Fitoöstrojen Östrojenik Aktiviteyi Taramak için Östrojen Reseptör-Raportör Aktivite Testi

Özet

Kaynak: Fender, E. et al., Hücre Bazlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojenlerin Taranması β Raportör Testi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, bitki türevli bileşiklerin östrojenik aktivitesini belirlemek için hücre bazlı bir raportör testi açıklanmaktadır. Östrojen benzeri aktiviteye sahip bir bileşik, östrojen reseptörlerine bağlanmasını taklit eder ve aşağı akış raportör enzim gen transkripsiyonunu yönlendirir. Raportör enzim, bileşiğin östrojenik aktivitesini gösteren bir reaksiyonda biyolüminesans üretir.

Protokol

1. Transfeksiyon testi β insan östrojen reseptörü

NOT: Test protokolünün 1. günü için aseptik teknik ve laminer akış başlığı gereklidir.

1. Standart eğri için 17β-Estradiol dilüsyonları hazırlayın.
   1. Hücre Geri Kazanım Ortamını ve Bileşik Tarama Ortamını (CSM) dondurucu deposundan aktarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda çözdürün.
   2. Mikrosantrifüj tüplerini Ara 1 ve 2 (INT1, INT2) ve 1-8 olarak etiketleyin.
   3. INT1'i 995 μL CSM ile, INT2'yi 615 μL CSM ile, tüp 1'i 900 μL CSM ile ve tüp 2-8'i 600 μL CSM ile doldurun. Tüp 8'i bir kenara koyun.
   4. 5 μL 100 μM 17β-Estradiol Stoğunu INT1'e aktarın. Ucu atın. Girdap.
   5. Her aktarımdan önce pipeti 3 kez durulayın ve ardından INT1'den INT2'ye 10 μL aktarın. Ucu atın.
   6. Pipeti 3 kez durulayın ve ardından INT2'den 100 μL'yi tüp 1'e aktarın. Ucu atın. 300 μL'yi tüp 1'den tüp 2'ye aktarın. 3'ten 7'ye kadar olan tüpler için tekrarlayın. 300 μL'yi tüp 7'den atık kabına atın. Tüp 8 bir Sıfırdır ve estradiol almaz. Kaplanmış standartların nihai konsantrasyonları şunlardır: 400, 133.3, 44.44, 14.815, 4.938, 1.646, 0.5487 ve 0 pM estradiol.
2. Örnek bileşikler hazırlayın.
   1. Vorteks örnekleri.
   2. DMSO'da her bitki örneğinden 4 μL alın ve% 0.8'lik bir DMSO çözeltisi elde etmek için 496 μL CSM'ye ekleyin.
3. Raportör Hücreleri hızla çözün.
   1. Hücre Geri Kazanım Ortamı tüpünü 37 ° C'lik su banyosundan alın. Dış yüzeyi %70 etanol kullanarak dezenfekte edin.
   2. Raportör Hücrelerini -80 ° C'lik depolamadan alın ve önceden ısıtılmış CRM'nin 10 mL'sini donmuş hücre tüpüne aktararak çözün.
   3. Raportör Hücrelerin tüpünü kapatın ve 5-10 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna aktarın.
   4. Reporter Cell Suspension tüpünü su banyosundan alın. Hücre agregalarını parçalamak ve homojen bir süspansiyon oluşturmak için hücre tüpünü birkaç kez nazikçe ters çevirin. Tüpün yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin.
4. Tahlil kaplaması.
   1. Çok kanallı bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa 100 μL Raportör Hücre Süspansiyonu dağıtın.
   2. 100 μL numuneyi üç nükte halinde uygun tahlil kuyucuklarına dağıtın.
   3. Plakayı 22-24 saat boyunca 37 °C, nemlendirilmiş %5 CO₂ inkübatöre aktarın.
5. 2. Güne hazırlanmak için Çözülme Algılama Alt Tabakasını ve Algılama Tamponunu gece boyunca karanlık bir buzdolabında çözün.
6. Plaka inkübasyonunun bitiminden hemen önce, Algılama Alt Tabakasını ve Algılama Tamponunu buzdolabından çıkarın ve RT'ye dengelenene kadar düşük ışıklı bir alana yerleştirin. RT'ye girdikten sonra, çözeltileri iyice karıştırmak için her tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin.
   1. İnkübasyon tamamlanmadan hemen önce, Luciferase Algılama Reaktifi oluşturmak için Algılama Tamponunun tüm içeriğini Algılama Substratı tüpüne dökün. Köpük oluşmaması için hafifçe karıştırın.
   2. Kuluçka tamamlandıktan sonra, içindekileri uygun bir atık kabına atmak için plakayı ters çevirin. Kuyucuklardaki son damlacıkları çıkarmak için plakayı temiz, emici bir kağıt havluya hafifçe vurun.
   3. Her oyuğa 100 μL Lusiferaz Tespit Reaktifi ekleyin. Tahlil plakasını RT'de 15 dakika dinlendirin. Plakayı sallamayın.
7. 96 oyuklu bir plaka okuma luminometresi kullanarak lüminesansı ölçün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1000 μL pipet
20 μL pipet
200 μL pipet
37 °C su banyosu
37 °C, nemlendirilmiş %5 CO2 inkübatörü
% 70 etanol
Analitik terazi
Hücre kültürü dereceli laminer akış başlığı
Dimetil sülfoksit
Tek kullanımlık medya havzası, steril
Damla filtrasyon sistemi
Erlenmeyer şişeleri			125 mL ve 250 mL
HPLC sınıfı metanol
İnsan ERβ Raportör Test Sistemi, 1 x 96 kuyucuklu format tahlilleri	İndigo Biyobilimler	IB00411	Tahlil kiti - 24 numuneyi ve standart eğriyi analiz eder
Liyofilizatör
Çok kanallı pipet
Yörünge çalkalayıcı
Plaka okuma luminometresi			eski Bioteck Sinerjisi HTX
Döner evaporatör
Yuvarlak tabanlı şişeler			50 mL ve 300 mL
Steril mikrosantrifüj tüpleri veya steril çok kanallı medya havuzları
Steril uçlar			200 μL ve 1000 μL
Whatman 1. sınıf kağıt
Whirl-pak çantalar			steril polietilen torbalar