Hücrelerde protein fosforilasyonunun izlenmesi için zamana bağlı Forster rezonans enerji transferi

Özet

Kaynak: Padros, J. et al., İnsan Hücrelerinde Endojen Fosforile STAT Proteinlerinin Ölçümü için Zamana Bağlı Förster Rezonans Enerji Transferi Testleri. J. Vis. Exp. (2021).

Bu video, bir test proteinine özgü antikorlar üzerinde etiketlenmiş donör ve alıcı floroforların yardımıyla endojen protein fosforilasyonunu belirlemek için zamana bağlı Förster rezonans enerji transferini veya TR-FRET testini açıklar. Bu teknik, hücre lizatlarındaki test proteinlerinin fosforilasyonunu ölçmek için tasarlanmıştır.

Protokol

1. Hücre kültürü

1. Hücreleri nemlendirilmiş 37 °C /% 5 CO₂ inkübatöründe ve %10 fetal sığır serumu (FBS) (HeLa ve A431 hücreleri) veya %15 FBS (U266B1 hücreleri) ile takviye edilmiş RPMI ile kültürde tutun. Hücreleri %70-80 birleşmeye ulaşana kadar kültürleyin, ardından tripsinize edin ve tahliller için geçiş yapın veya kullanın.
   not: Kültür ortamı fenol kırmızısı içeriyordu. Tahliller yapılmadan önce herhangi bir hücre hattı için serum açlığı yapılmamıştır.

2. Yapışık hücrelerle iki plakalı tahlil protokolünü kullanarak stimülatör veya inhibitör titrasyonu

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
96 oyuklu mikroplaka, şeffaf, düz dipli, polistiren, doku kültürü ile tedavi edilmiş, steril	Corning	3595	Bu, iki plakalı tahlil protokolünü kullanırken hücrelerin kültürlenmesi için kullanılan plakadır. Diğer hücre kültürü 96 oyuklu plakalar kullanılabilir
384 oyuklu mikroplaka, beyaz, düşük hacimli	PerkinElmer	6007290	Bu, iki veya tek plakalı tahlil protokolleri kullanılırken TR-FRET tespiti için kullanılan plakadır. Diğer düşük hacimli, beyaz 384 oyuklu plakalar kullanılabilir
A431 hücre hattı	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-1555
Yapışkanlı mikroplaka contası	PerkinElmer	6050185
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM)	avrupa bizonu	319-005-CL	THUNDER TR-FRET, fenol kırmızısı içeren kültür ortamı ile uyumludur
EnVision Xcite Çok Etiketli Plaka Okuyucu	PerkinElmer	2104-0020A	Tahliller, TR-FRET seçeneği ile donatılmış çeşitli plaka okuyucular üzerinde gerçekleştirilebilir
HeLa hücre hattı	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-2
Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 orta (RPMI)	avrupa bizonu	350-007-CL	THUNDER TR-FRET, fenol kırmızısı içeren kültür ortamı ile uyumludur
Tripsin/EDTA %0,05	avrupa bizonu	325-542-CL
Ultra saf su	Na	Na	Lizis Tamponu ve Tespit Tamponunu seyreltmek için Milli-Q dereceli su (18 MΩ.cm) kullanın

Serisi Serisi