İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir
1. İnsan nöral progenitör hücrelerinin (hNPC'ler) izolasyonu ve kültürü
- Beyin dokusunu 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve forseps kullanarak meninksleri dikkatlice çıkarın.
- Beyin dokusunu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve tüpü nazikçe ters çevirerek 20 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- Beyin dokusunu 50 mL'lik yeni bir konik tüpte, dokuyu hücre ayrışma solüsyonuna (Malzeme Tablosuna bakınız) ve DNaz I'e (10 U/mL) 37 ° C'de 10 dakika daldırarak inkübe edin.
- Beyin dokusu içeren tüpe 5 mL nöronal hücre kültürü ortamı (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon yapmak için 1000 μL'lik bir pipet ucundan 20 ila 30 kez tritüre ederek nörosferleri mekanik olarak ayırın.
- Hücre kümelerini çıkarmak için hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
- Tek hücreli süspansiyonu, Tablo 25'de ayrıntıları verilen bileşenlerle desteklenmiş 5-10 mL nöronal hücre kültürü ortamı ile havalandırmalı bir T-1 şişesine tohumlayın.
- Heparin çözeltisini 0.2 μm'lik bir filtreden süzülerek sterilize edin. A vitamini içermeyen B-27 takviyesi, farklılaşmaya neden olmadan nöral progenitörlerin ve kök hücrelerin yetiştirilmesi için serum içermeyen bir takviyedir.
not: İnsan nöral progenitör hücreleri (hNPC'ler), iptal edilmiş bir fetüsten toplanan bir insan fetal beyninden izole edilir. Kültürde 7-10 gün sonra, nöral kök hücreler (NSC'ler) serbest yüzen nörosfer kolonileri oluştururken, diğer hücre tipleri tek hücreler olarak süspansiyon halinde kalır veya şişenin dibine yapışır. İzole edilen hNPC'ler birkaç ay boyunca süspansiyon halinde nöroküreler olarak kültürlenebilir.
2. hNPC'leri geçirme
- Yüzen küreleri, büyük ve küçük nöroküreleri içeren ortamı toplayın ve bunları 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
not: Bilinmeyen nedenlerden dolayı, nörosferlerin bölünme zamanlaması 7 gün ile 30 gün arasında değişmektedir. Bununla birlikte, genel olarak, nörosferlerin 700-900 μm'den daha büyük bir çapa ulaştıklarında geçilmesi gerekir. Bu, nörosferin merkezinin kararmaya başladığı zamandır ve bu, yüksek hücre ölümü oranının bir işareti olarak kabul edilir.
- Nörosferleri 3 dakika boyunca 300-400 x g'da santrifüjleme ile döndürün.
- Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve ardından küreleri 500 μL çözülmüş hücre ayrışma reaktifine batırın (bkz. Malzeme Tablosu).
- 1.5 mL mikrotüplere 500 μL ekleyerek hücre ayrışma reaktifinin alikotlarını yapın ve -20 ° C'de saklayın. Enzim aktivitesini kaybetmemek için, hücre ayrışma reaktifini RT'de tutarak veya 37 ° C'lik bir su / boncuk banyosunda 5 dakika ılık olarak çözün.
- Kürelerin yoğunluğuna ve boyutuna bağlı olarak, batık küreleri 37 °C'de 5-15 dakika inkübe edin.
- 50 mL konik tüp içeren nörosperlere 5-10 mL önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin ve nörosferleri çökeltmek için 300-400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve 1000 μL'lik bir pipet kullanarak, tüm nöroküreler tek hücreli bir süspansiyona girene kadar 2 mL kültür ortamında nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
not: Ayrışma çıplak gözle görülebilir hale gelecektir. Ayrışmadan önce, nörosferler küreler şeklindedir. Ayrışma reaktifine daldırıldıktan ve yukarı ve aşağı pipetlendikten sonra, tek hücreler haline gelirler.
- T-25 şişesi başına 2 ila 3 milyon hücre olan tek hücreleri 10 mL kültür ortamında sayın ve plakalayın.
- Kültür ortamının yarısını değiştirerek hücreleri her 3 günde bir besleyin.
- Şişeyi alt köşesinde olacak şekilde eğerek nöroküreleri yerleştirin. Şişeyi, nörosferler çökelene kadar yaklaşık 1-2 dakika pozisyonda tutun. Ardından, serolojik pipeti yerleşmiş nörosferlerin üzerindeki ortama sokarak ortamın yarısını nazikçe aspire edin. Ayrışmış hücreler, kültürde 2 ila 3 gün sonra küreler oluşturmak üzere toplanabilir.
3. hNPC'lerin dondurulması
- Kültür ortamına %10'luk (h/h) bir nihai konsantrasyona DMSO ekleyerek hücre dondurma ortamını hazırlayın veya hassas hücre tipleri için ticari olarak temin edilebilen bir kriyoprezervasyon ortamı kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Ortamı 50 mL'lik konik bir tüpe aktararak ve kürelerin yerçekimi ile yerleşmesine izin vererek büyük küreleri ayırın. Daha sonra büyük nöroküreleri çıkarın ve 200 veya 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak geçiş için 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
not: Çapı 900 μm'den büyük olan nöroküreler büyük, çapı 500 μm'den küçük olanlar ise küçük olarak kabul edilir.
- Kalan nöroküreleri 3 dakika boyunca 300-400 x g'da santrifüjleme ile döndürün. Süpernatanı dikkatlice çıkarın.
- 1 mL kriyoprezervasyon reaktifinde 100 küreye kadar yeniden süspanse edin ve bir kriyotüpe aktarın.
- Gece boyunca -80 °C'de bir hücre dondurma kabında saklayın (Malzeme Tablosuna bakın) ve uzun süreli saklama için ertesi gün sıvı nitrojene taşıyın.
not: Küçük ila orta büyüklükteki nörosferlerin (çapı 900 μm'den küçük) dondurulması ve büyük boyutlu nörosferlerin (çapı 900 μm'den büyük) veya tek hücrelerin dondurulmasından kaçınılması tercih edilir. Numuneyi çözdürürken hücre hasarını azaltmak için, çözülmüş nörosferleri küçük bir T25 şişesine ekerek hücreleri yoğun tutun.
4. Nörotoksisite değerlendirmesi
NOT: Test bileşiklerinin sitotoksisitesi, bir ışıldayan hücre canlılığı deneyi kullanılarak 384 oyuklu plakalarda (Malzeme Tablosuna bakınız) değerlendirilir (bkz. Malzeme Tablosu). hNPC'ler, "hNPC'lerin Farklılaşması ve Tedavisi" bölümünde açıklanan küçük değişiklikler dışında aynı yöntem izlenerek hazırlanır. Daha sonra, ışıldayan hücre canlılık deneyi ile üretilen bir ışıldayan sinyal, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçülür. Lüminesan sinyal, her bir oyukta bulunan canlı hücrelerin sayısı ile doğru orantılı olan hücresel ATP konsantrasyonu ile orantılıdır.
- Kaplama
- 384 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 30 μL poli-L-lizin (PLL) ekleyin.
- RT'de 1 saat inkübe edin.
- PBS ile 2 kez yıkayın.
- RT'de kurumaya bırakın (yaklaşık 30 dakika).
- 384 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 30 μL laminin (50 μg/mL) ekleyin.
- 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
- PBS.
ile 2 kez yıkayın
not: Kaplamalı 384 oyuklu plakalar 4 °C'de 1 ay saklanabilir.
- Hücrelerin kaplanması
- 25 μL farklılaşma ortamında 384 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 20.000 tek hücreli nöroküreyi sayın ve plakalayın.
- 37 °C'de 5 gün inkübe edin.
- 5 gün sonra, hücreleri 24 saat boyunca, 5 μL hacimde istenen nihai konsantrasyonun 6 katında hazırlanan test bileşikleri ile tedavi edin (kuyu başına 30 μL'lik nihai hacmi yapmak için).
- Hücre canlılığı testi
- 384 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 30 μL ışıldayan hücre canlılığı tahlil reaktifi ekleyin.
not: Her bir oyukta bulunan hacme eşit bir hacimde ışıldayan hücre canlılığı tahlil reaktifi ekleyin. Lüminesan hücre canlılık tahlil reaktifini çözün ve kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
- Bir tabak çalkalayıcı üzerinde 2 dakika çalkalayın (karıştırmak ve hücre lizizini indüklemek için).
- Karışımı 30 saniye boyunca 300-400 x g'da santrifüjleme ile döndürün.
- 384 oyuklu plakayı RT'de ışıktan korunan bir yerde (ışıldayan sinyali stabilize etmek için) 10 dakika inkübe edin.
- Mikroplaka okuyucu ile lüminesansı kaydedin.
not: Pozitif olarak Velcade (10 μM'lik bir nihai konsantrasyonda) ve negatif kontrol olarak DMSO (% 0.1 veya% 0.2'lik bir nihai konsantrasyon ile) içeren HBSS dahil olmak üzere canlılık testi için uygun kontrolleri kullanın.
Tablo 1. 100 mL kültür ortamı yapmak için gerekli bileşenler
| miktar | parça |
| 100 μL | EGF (20 ng/mL) |
| 100 μL | FGF (10 ng/mL) |
| 2 mL | B-27, eksi A vitamini (50X) |
| 1 mL | L-alanil-L-glutamin (100X) (malzeme tablosuna bakınız) |
| 4 μL | Heparin (2 μg/mL) |
| 96,8 mL | Nöronal hücre kültürü ortamı (malzeme tablosuna bakınız) |
