Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="her zaman">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm Çember Kapak Slipi</td>
			<td>Termo Bilimsel</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Kullanmadan önce sterilize edin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sitokalasin D</td>
			<td>Canlandırıcı</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>DMSO'da çözüldü</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plazmid Maxi Kiti</td>
			<td>QIAGEN (Türkçe)</td>
			<td>12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floresan Montaj Ortamı</td>
			<td>Dako Belediyesi</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td>
			<td>Canlandırıcı</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td> Gazetesi
			<td>P6148 Serisi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td> Serisi
			<td>Clontech teknolojisi</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lütfen referans 8 ve 15'e bakınız</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tabletler</td>
			<td>Gibco (Gibco)</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penisilin-Streptomisin</td>
			<td>Gibco (Gibco)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poli-D-lizin hidrobromür</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td> Gazetesi
			<td>P7280 Serisi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spatula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td> Gazetesi
			<td>S4147 Serisi</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td>
			<td>Gibco (Gibco)</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hedef proteinlerin nötrit büyümesi Üzerindeki etkisini değerlendirmek için İmmünofloresan testi

Kaynak: Chan, W., W., R. et al. <a href="https://app.jove.com/v/60031">Primer Nöronlarda Nörit Büyümesini İncelemek için Gelişmiş Yeşil Floresan Proteini Bazlı Bir Test.</a> (2019).
Bu videoda, hedef proteinlerin primer kortikal nöronların nörit büyümesi üzerindeki etkinliğini belirlemek için EGFP bazlı bir immünofloresan testi gösteriyoruz. Birincil nöronlar bir floresan proteini, EGFP ve bir hedef protein ile transfekte edilir ve daha sonra hedef proteinin nörit büyümesi üzerindeki etkisini araştırmak için bir immünolojik test yapılır.

Hedef Proteinlerin Nötrit Büyümesi Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için İmmünofloresan Testi

Kaynak: Chan, W., W., R. et al. Primer Nöronlarda Nörit Büyümesini İncelemek için Gelişmiş Yeşil Floresan Proteini Bazlı Bir Test. J. Vis. Uzm. 
...

Gelişmekte olan nöronlar, nöronlar arası iletişim için gerekli olan dendritleri ve aksonları geliştirmek için nörit büyümesi yoluyla hücre gövdelerinden sitoplazmik süreçleri genişletir.
Bir hedef proteinin nörit büyümesi üzerindeki etkisini incelemek için, tabanında poli-D-lizin kaplı bir lamel bulunan çok kuyulu bir plaka alın. Lamelin yüzeyi, embriyonik sıçan beyninden türetilen yapışık bir birincil kortikal nöron kültürüne sahiptir.
Nöronları iki tip plazmit içeren bir karışımla tedavi edin - gelişmiş yeşil floresan proteini kodlayan bir EGFP plazmidi ve hedef proteini uygun bir transfeksiyon reaktifinde kodlayan ikinci bir plazmit.
Transfeksiyon reaktifi, plazmitlerin hücrelere girişini kolaylaştırır.
Transfeksiyon sonrası, her iki plazmit de eksprese edilir, yeşil floresan proteinleri ve hedef proteinleri üretir. EGFP'nin ekspresyonu, ko-transfekte edilmiş hücrelere yeşil floresan verir.
Nörit büyümesini uyarma potansiyeline sahip hedef proteinler, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesini teşvik eden ve nöronal projeksiyonların ve uzantılarının gelişmesine yol açan hücresel sinyallemeyi başlatır.
Harcanan ortamı aspire edin ve hücreleri paraformaldehit ile sabitleyin. Hücreleri, eksprese edilen hedef proteinleri spesifik olarak bağlayan ve hücrelere ek kırmızı floresan veren kırmızı floresan etiketli anti-hedef protein antikorları kullanarak karşı boyayın.
Lameli kültür plakasından çıkarın ve bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
Çift renkli bir floresan sinyali sergileyen ko-transfekte edilmiş hücreler, kırmızı floresan içermeyen hücrelerden daha uzun nöronal süreçler gösterir ve bu da hedef proteinin nörit büyümesi üzerindeki uyarıcı etkisini doğrular.

37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki gün sonra, EGFP ve hedef protein plazmid DNA'larını ve transfeksiyon reaktifini iki ayrı 1.5 mililitrelik tüpte seyreltin ve ardından bunları karıştırın. Transfeksiyon karışımını kuyucuklara ekleyerek hücreleri EGFP yapısı ile transfekte edin.
24 saat sonra, hücreleri 37 santigrat derece PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
İnkübasyonun sonunda, sabit hücreleri yıkama başına taze PBS ile üç kez yıkayın ve numune başına bir mikroskop cam lam üzerine minimum hacimde floresan montaj ortamı ekleyin. Ardından, kaplanmış lamelleri, numuneler cam slaytlara bakacak şekilde dikkatlice montaj ortamına aktarın.
Nörit büyümesini görüntülemek için, epi-floresan mikroskopta 40x objektifi seçin ve transfeksiyon başına en az 40 sağlam EGFP pozitif nörondan görüntü yakalamak için "Başlat"a tıklayın.
Tüm yeni haklar görüntülendiğinde, yakalanan görüntüleri NeuronJ eklentisi ile ImageJ'de açın ve hücre gövdesinden büyüme konisinin ucuna kadar her nöronun en uzun nöritinin uzunluğunu ölçün. Ardından, hedeflenen proteinlerin nörit büyümesi üzerindeki etkisini belirlemek için yazılımla elde edilen verileri analiz edin.

immunofluorescence-assay-to-evaluate-effect-target-proteins-on

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Biyolojik Teknikler

Assay Techniques

Analiz Teknikleri

Immunoassays

İmmünolojik analizler

Immunofluorescence Assay to Evaluate Effect of Target Proteins on Neurite Outgrowth

993 Görüntüleme. Gelişmekte olan nöronlar, nöronlar arası iletişim için gerekli olan dendritleri ve aksonları geliştirmek için nörit büyümesi yoluyla hücre gövdelerinden sitoplazmik süreçleri genişletir. Bir hedef proteinin nörit büyümesi üzerindeki etkisini incelemek için, tabanında poli-D-lizin kaplı bir lamel bulunan çok kuyulu bir plaka alın. Lamelin yüzeyi, embriyonik sıçan beyninden türetilen yapışık bir birincil kortikal nöron kültürüne sahiptir. Nöro...

Hedef Proteinlerin Nötrit Büyümesi Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için İmmünofloresan Testi

Bu makalede

Özet

Açıklamalar

Malzemeler

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
18 mm Çember Kapak Slipi	Termo Bilimsel	CB00180RA	Kullanmadan önce sterilize edin
Sitokalasin D	Canlandırıcı	PHZ1063	DMSO'da çözüldü
EndoFree Plazmid Maxi Kiti	QIAGEN (Türkçe)	12362
Floresan Montaj Ortamı	Dako Belediyesi	S302380
Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi	Canlandırıcı	11668019
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148 Serisi
pEGFP-C1	Clontech teknolojisi	#6084-1
pCI FE65			Lütfen referans 8 ve 15'e bakınız
PBS Tabletler	Gibco (Gibco)	18912014
Penisilin-Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140122
Poli-D-lizin hidrobromür	Sigma-Aldrich	P7280 Serisi
spatula	Sigma-Aldrich	S4147 Serisi
Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı	Gibco (Gibco)	25300062