$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Plazmitlerin ekspresyonunun hücrelere geçici transfeksiyonu
- Yapışık HEK293T hücre kültürünü tripsinizasyon ile hasat edin ve hücreleri özel bir tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri (2 x 104/100 μL/kuyucuk) şeffaf bir alt, beyaz tarafı 96 oyuklu plaka üzerine yerleştirin. Replikasyonlar da dahil olmak üzere test edilen tüm kombinasyonları ve kontrolleri barındırmak için toplam kuyu sayısını ayarlayın.
not: Termal kaymaları en aza indirmek ve gece boyunca buharlaşmayı önlemek için plakanın yalnızca iç 60 kuyusunu kullanmaya çalışın. Malzeme Tablosunda belirtilenler gibi poli-D-lizin kaplı plakaların kullanılması şiddetle tavsiye edilir, aksi takdirde hücreler sonraki yıkama adımları sırasında ayrılabilir.
- Hücreleri gece boyunca standart koşullarda (37 °C,% 5 CO2) kültürleyin.
- Ertesi gün, hücreleri istenen ekspresyon plazmit kombinasyonları ile transfekte edin.
- Ekspresyon plazmitlerini serum içermeyen bir ortamda seyreltin (Malzeme Tablosuna bakınız) her yapı için 6.25 ng / μL'ye.
- Lipid bazlı transfeksiyon reaktifini uygun bir lipid-DNA oranında ekleyin ve üreticinin talimatlarına göre inkübe edin.
- Belirlenen kuyucuklara 8 μL lipit: DNA karışımı ekleyin. Plakanın içeriğini hafifçe döndürerek karıştırın. Bu, her iki ekspresyon yapısının 50 ng / kuyuda transfeksiyonu ile sonuçlanır.
- Hücreleri standart koşullarda (37 ° C,% 5 CO2) 20-24 saat kültürleyin.
not: Hücrelerin daha uzun süre kültürlenmesi, daha yüksek seviyelerde füzyon proteini ekspresyonu ile sonuçlanabilir ve bu da fragmanlar arasında spesifik olmayan bir ilişkiyi teşvik edebilir.
2. Orta değişim
- Ertesi gün, şartlandırılmış ortamı her kuyucukta 100 μL serumsuz bir ortamla değiştirin. Ortam değişiminde hücrelerin ayrılmadığından emin olun.
not: Bu adım, furimazin çalışma çözeltisinin eklenmesinden 2-3 saat önce yapılmalıdır. Serum yoksunluğu, furimazinin otomatik lüminesansının neden olduğu arka planı en aza indirir.
3. Furimazin çalışma çözeltisinin hazırlanması
- Ölçümden hemen önce, 1 hacim furimazini 19 hacim seyreltme tamponu (20 kat seyreltme) ile karıştırın.
not: Hazırlanacak furimazin çalışma çözeltisinin toplam hacmi, analiz edilecek bireysel kuyucukların sayısına bağlıdır (furimazin çalışma çözeltisi, hücre kültürü ortamına 1: 5 oranında eklenir, bu nedenle, daha önce 100 μL serum içermeyen bir ortamla doldurulmuş her bir oyuğa 25 μL furimazin çalışma çözeltisi eklenmelidir).
- Furimazin çalışma çözeltisini belirlenen kuyucuklara (25 μL / kuyu) ekleyin. Plakayı elle veya bir orbital çalkalayıcı kullanarak nazikçe karıştırın (örn. 300-500 rpm'de 15 s).
4. Lüminesans ölçümü
- Plakayı bir lüminesans mikroplaka okuyucusuna yerleştirin.
- 37 °C'de yapılacak deneyler için, plakayı belirtilen sıcaklıkta 10-15 dakika dengeleyin.
- Analiz edilecek kuyuları seçin.
- 0,3 s'lik bir entegrasyon süresiyle lüminesansı okuyun. Gerektiğinde 2 saate kadar lüminesansı izlemeye devam edin.