Beyin Lizatında Hedef Protein Seviyelerinin Ölçülmesi için Elektrokemilüminesans Testi

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir

1. MeCP2-ECLIA protokolü

1. Yıkama çözeltisinin hazırlanması, tamponun bloke edilmesi ve seyreltici çözeltinin tahlil edilmesi (1. gün)
   1. PBS çözeltisinde %0,05'lik bir Tween 20 hazırlamak için 500 μL Tween 20 ila 1 L PBS ekleyin, kuvvetlice karıştırın ve "yıkama çözeltisi" olarak etiketleyin.
      not: Sadece yeni hazırlanmış yıkama tamponunun kullanıldığından emin olun.
   2. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 3 bloker A'dan (Malzeme Tablosu) oluşan bir blokaj çözeltisi hazırlayın. Hafifçe karıştırarak karıştırın, süzün, sterilize edin ve en fazla iki hafta kullanana kadar buzdolabında saklayın.
   3. Seyreltici solüsyonu hazırlamak için 10 mL PBS'ye 5 mL bloke edici solüsyon ekleyin (PBS'de %1 bloker A).
2. Yüksek bağlama plakalarının kaplanması
   1. 96 kuyulu çok dizili, tek noktalı yüksek bağlama plakasını çıkarın.
      not: Yüksek bağlama plakaları, hidrofobik yüzeylere sahip standart plakalardan daha büyük bir bağlama kapasitesine ve dolayısıyla daha geniş bir dinamik aralığa sahiptir.
   2. Monoklonal fare anti-MeCP2 antikorunu buz üzerinde çözün ve 0.67 μL antikoru 4 mL PBS (PBS'de 1: 6.000 antikor seyreltmesi) ile karıştırın. İyice karıştırmak için antikor çözeltisini girdap haline getirin ve tüpü "kaplama çözeltisi" olarak etiketleyin.
   3. Çok kanallı bir pipetleyici kullanarak her bir oyuğun alt köşesine 25 μL kaplama solüsyonunu dikkatlice dağıtın; buna çözelti kaplama yöntemi denir. Kaplama çözeltisinin her bir kuyunun dibini kapladığından emin olmak için 96 oyuklu plakayı her iki tarafa hafifçe vurun.
   4. Plakayı yapışkan bir folyo ile kapatın ve plakayı gece boyunca (12-16 saat) buzdolabında 4 °C'de inkübe edin.
3. Engelleme (2. gün)
   1. Plakayı buzdolabından çıkarın ve folyoyu çıkarın.
   2. Antikor kaplama solüsyonunu atık sepetine iterek çıkarın ve tüm kaplama solüsyonunu kuyucuklardan çıkarmak için plakayı bir kağıt havluya vurun.
   3. Kuyucuk başına 125 μL engelleme çözeltisi ekleyin. Plakayı tekrar kapatın ve orbital bir mikro plaka çalkalayıcıya yerleştirin.
   4. Plakayı 800 rpm'de sürekli çalkalayarak oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin.
4. Standartların ve numunelerin hazırlanması
   1. Kuluçka süresi boyunca MeCP2 ve/veya TAT-MeCP2 protein standartlarını ve çeşitli numuneleri hazırlayın.
      not: Standart seyreltme için kullanılan lizis tamponu, analiz edilen numunelerde kullanılanla aynı olmalıdır.
   2. -80 °C'den bir şişe MePC2 ve/veya TAT-MeCP2 protein stok çözeltisi (250 μg/mL), fare beyni lizatları ve HDF lizatlarını çıkarın.
   3. Standart stok çözeltisini (MeCP2 ve/veya TAT-MeCP2) Tablo 1'e göre temiz tüplerde seyreltin.
   4. Numuneleri lizis tamponunda şu şekilde seyreltin: 25 μL lizis tamponu başına 1-20 μg fare beyni lizatı ve 25 μL lizis tamponu başına 0.25−1 μg HDF lizat. Analizi üç nüsha halinde yapmak için her numuneden yeterli miktarda hazırlayın.
5. Örneklerin ve standart çözümlerin eklenmesi
   1. Engelleme solüsyonunu atık sepetine iterek çıkarın ve tüm blokaj solüsyonunu kuyucuklardan çıkarmak için plakayı bir kağıt havluya vurun.
   2. Plakayı 3x 150 μL yıkama solüsyonu ile yıkama solüsyonunu ekleyerek ve hemen çıkararak yıkayın.
   3. Tek kanallı bir pipet kullanarak kuyunun alt köşesine 25 ul standart ve numune ekleyin.
   4. Plakayı kapatın ve plakayı 800 rpm'de sürekli çalkalayarak oda sıcaklığında 4 saat inkübe edin.
6. Etiketlenmemiş tespit antikoru
   1. Poliklonal tavşan anti-MeCP2 antikorunu buz üzerinde çözdürün. Antikoru 1: 6.000 oranında test seyreltici solüsyonunda seyreltin.
   2. Standartları ve numuneleri çöp sepetine atarak çıkarın ve plakayı bir kağıt havluya vurun.
   3. Plakayı 3x 150 μL yıkama solüsyonu ile yıkama solüsyonunu ekleyerek ve hemen çıkararak yıkayın.
   4. Çok kanallı pipetleyici ile her oyuğa 25 μL etiketsiz tespit antikoru ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında 800 rpm'de sürekli çalkalayarak 1 saat inkübe edin.
7. Spesifik konjuge antikor
   1. Spesifik ikincil antikoru (Malzeme Tablosu) buzdolabından çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Antikoru 1: 666.67 test seyreltici çözeltisinde seyreltin ve hafifçe karıştırın.
   2. Serbest etiketlenmemiş ikincil antikoru atık sepetine iterek çıkarın ve plakayı bir kağıt havluya vurun.
   3. Plakayı 3x 150 μL yıkama solüsyonu ile yıkama solüsyonunu ekleyerek ve hemen çıkararak yıkayın.
   4. Çok kanallı pipetleyici ile her bir oyuğa 25 μL spesifik konjuge antikor (Malzeme Tablosu) ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında 800 rpm'de sürekli çalkalayarak 1 saat inkübe edin.
8. Plakayı okumak
   1. Serbest konjuge antikoru (Malzeme Tablosu) atık sepetine iterek çıkarın ve plakayı bir kağıt havluya vurun.
   2. Plakayı 3x 150 μL yıkama solüsyonu ile yıkayın.
   3. Plakaya ışık üretimi için yardımcı reaktan olarak tripropilamin içeren yüzey aktif madde içeren 150 μL 1x Tris bazlı Altın okuma tamponu (Malzeme Tablosu) ekleyin. Ters pipetleme tekniklerini kullanarak hava kabarcıklarını önleyin.
   4. Plakayı mikroplaka algılama platformuna (Malzeme Tablosu) yerleştirin ve ölçümü hemen başlatın. 96 kuyulu plaka alımı için ayarları kullanın.
   5. Elektrokemilüminesans sinyallerini bir elektrokemilüminesans algılama sistemindeki (Malzeme Tablosu) yerleşik bir CCD kamera ile yakalayın ve bağıl ışık birimlerine (RLU) karşılık gelen ve ışığın yoğunluğuyla doğru orantılı olan sinyal sayılarını kaydedin.
      not: Elektrokimyasal stimülasyon üzerine, karbon elektroda bağlı rutenyum etiketi, 620 nm'de lüminesans ışığı yayar. Cihaz eşliğinde sunulan yazılımla verileri analiz edin (Malzeme Tablosu).

Tablo 1: 0 ila 1.800 ng/mL arası standart seriler.