Hedef Genlerde Indel Mutasyonu Tespiti için Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Özet

Kaynak: Carballar-Lejarazú, R., et al. Genetiği Değiştirilmiş Anofelin Sivrisinek Popülasyonlarında Indels Mutasyonlarını Tespit Etmek için Dijital Damlacık PCR. (2021).

Bu video, bir DNA örneğindeki indel mutasyonunu tanımlamada dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonunun rolünü göstermektedir. ddPCR'nin yüksek hassasiyeti ve hassasiyeti, düşük seviyelerde bile bir numunede bulunan nadir mutasyonların doğru ve tutarlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Genomun farklı bölgelerindeki indel mutasyonlarını tanımlayabilir ve ölçebilir, mutasyon mekanizmaları ve bu mutasyonların işlevsel sonuçları hakkında değerli bilgiler sağlar.

Protokol

1. ddPCR reaksiyonları ve damlacık oluşturma hazırlığı

1. Bir florometre kullanarak DNA'yı ölçün.
   not: Bırakma testi için, reaksiyon başına 3.000-30.000 haploid genom kopyası kullanılması tavsiye edilir, bu da hedeflenen kesim bölgesinin bir WT dizisine bağlanan ve hedef bölgede bir silme veya yerleştirme varsa tavlama (bırakma) yapmayacak bir HEX etiketleme probu ile NHEJ olaylarını tespit etmek için tasarlanmıştır, bir NHEJ varyantının varlığını gösterir.
2. Ekstrakttaki haploid genom ağırlığını ve DNA konsantrasyonunu kullanarak kopya sayısını hesaplayın. Bu, ekstrakte edilen DNA'nın konsantrasyonunun, toplam DNA kütlesini elde etmek için kullanılan hacimle çarpılması ve ardından haploid genom ağırlığına bölünmesiyle yapılır. Eklenen hacmin 1-10 μL arasında olduğundan emin olun. Önerilen haploid genom kopya aralığında olmak için gerektiği kadar seyreltin.
   not: Bir Anopheles gambiae haploid genomunun yetişkin sivrisinek başına 0.27 pg olduğu tahmin edilmektedir.
3. Astarlar ve problar tasarlayın. 150-400 bp'lik bir amplikon üreten, gRNA hedef bölgesinin 5' ve 3' uçlarını çevreleyen 55-60 °C aralığında bir Primer Erime Sıcaklığına (Tm) sahip ileri ve geri oligonükleotid primerleri tasarlayın.
   1. NHEJ tespiti için HEX (Hekzakloro-floresein) etiketli prob: Hedef bölgeyi tamamlayıcı olarak ~ 15-20 bp uzunluğunda bir oligonükleotid tasarlayın ve HEX probunu 5' ucuna ve BHQ1'i (BLack Hole Quencher 1) 3' ucuna ekleyin. Hidroliz probunun Tm'si, primerlerin Tm'sinden 3-10 °C daha yüksek olmalıdır.
   2. Referans WT için FAM (6-karboksifloresein) etiketli prob: Hedef bölgeden uzakta (yaklaşık 25 bp) korunmuş bir genom bölgesini tamamlayan ~ 15-20 bp uzunluğunda bir oligonükleotid tasarlayın ve FAM probunu 5' ucuna ve BHQ1'i 3' ucuna ekleyin. Hidroliz probunun Tm'si, primerlerin Tm'sinden 3-10 °C daha yüksek olmalıdır.

2. PCR reaksiyonu hazırlığı

1. Aşağıdaki bileşenlerle 25 μL ddPCR Numune Karışımı hazırlayın: problar için ddPCR süper karışımı (UTP yok): 12,5 μL, ileri ve geri primerler (10 μM): her biri 1 μL, HEX/FAM probları (10 μM): her biri 0,625 μL, DNA: 1-5 μL (3.750-37.500 haploid genom kopyası) ve su: 25 μL'ye kadar.
2. Reaksiyonları girdap veya geri akış pipetleme (yukarı ve aşağı) (20x) ile iyice karıştırın.
   not: Reaksiyonlar 96 oyuklu bir plakadaysa, kabarcık oluşumunu önlemek için girdap yapmak yerine tüm hacmi 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
3. Karışımı tüpün veya kuyunun dibine çökeltmek için numuneleri kısaca santrifüjleyin.
   not: Damlacık oluşumu için reaksiyonların oda sıcaklığında olduğundan emin olun. Her kartuşta ekstra/kullanılmayan kuyucuklar için 1 adet ddPCR karışımı hazırlayın (her kartuşta 8 kuyucuk vardır).

3. Damlacık üretimi

1. 50 μL'lik çok kanallı bir pipet kullanarak, 20 μL ddPCR s'yi yükleyinampkartuşun orta sırasına karışım (Şekil 1A, üst).
2. Alt sıraya 70 μL yağ yükleyin. Kullanılmayan kuyucuklara 20 μL 1x ddPCR süper karışımı yükleyin.
   not: Baloncuklar sokmayın.
3. Contayı, ortadaki içbükey alandan kaçınarak yalnızca kenarlara değecek şekilde yerleştirin (Şekil 1B).
4. Plakayı damlacık üretecine güvenli bir şekilde yerleştirin ve çalışmayı başlatmak için kapağı kapatın.
5. Çok kanallı pipeti kullanarak, kartuşun üst sırasından (Şekil 1A, alt) 40 μL emersiyon karışımını 96 oyuklu plakaya aktarın.
   1. Sıvı numuneyi 3-5 saniye boyunca 45-30°'lik bir açıyla çizin. Karışımı 3 saniyeden fazla bir süre boyunca 45°'lik bir açıyla kuyunun kenarına yavaşça boşaltın ve yandan aşağı damlamasına izin verin. Tüm sıvıyı dışarı atmak için pipetin ikinci durağına (tamamen dışarı atılması) gitmek sorun değil.
6. Folyo ısı contaları kullanarak plakaları 180 °C'de 5 saniye boyunca kapatın.

4. PCR

1. Mühürlü plakayı termodöngüleyiciye yerleştirin (Şekil 1C) ve NHEJ Bırakma yönergelerini izliyorsanız önerilen PCR koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın:
   1. 95 ° C'de 10 dakika boyunca ilk denatürasyon.
   2. Denatüre etmek için 30 saniye boyunca 94 °C'lik 40 döngü, tavlamak için 1 dakika boyunca 55 °C ve uzatmak için 2 dakika boyunca 60 °C ayarlayın.
   3. 98 °C'de 10 dakika tutun.
   4. 4 °C.
      'de tutun not: Belirli astarlar ve prob setleri için tavlama sıcaklığı, bir termal gradyan kullanılarak optimize edilebilir. Tüm adımlar için 2 °C/sn'lik bir rampa hızı kullanın. PCR koşulları, her deney tasarımına ve kurulumuna bağlı olarak ayarlanmalıdır.

5. Damlacık okuma

1. Plakayı, sol üstte A-1 kuyusu olacak şekilde damlacık okuyucuya güvenli bir şekilde yerleştirin (köşe düzleştirilmiş, diğer üçü kenarlıdır) (Şekil 1D).
2. Programda plakayı ayarlayın: FAM'ı bilinen referans kanalı ve HEX'i bilinmeyen kanal olarak belirleyin (Şekil 2A).
3. Damlacık okuma deneyini doğrudan niceleme olarak çalıştırın. Çalıştırma bittikten sonra, analiz için Deney türünü Bırakma (DOF) olarak değiştirin (Şekil 2A).

Sonuçlar

Şekil 1: Deney düzeneği ve prosedürü. (A) Damlacık oluşumu için kartuş hazırlığı. (Yukarıya) Numuneler kartuşun orta sırasına, yağ ise alt sıraya doldurulur. (Altta) Damlacık oluşumundan sonra emülsifiye damlacıklarla dolu üst sıra. (B) Numune ile doldurulmuş ve yerinde bir conta ile kapatılmış bir kartuşa sahip damlacık üreteci. (C) Bir Termo-Döngüle...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif
Problar için ddPCR Süper Karışım (dUTP yok)	Biyo-Rad	1863024
EDTA (pH 8.0)	Canlandırıcı	AM9260G
PCR sınıfı Su			Herhangi bir sertifikalı PCR sınıfı su kullanılabilir
Proteinaz K 20 mg/mL	Thermo Fisher Bilimsel	AM2546
Malzeme
ddPCR 96 Kuyulu Plaka	Biyo-Rad	12001925
Damlacık Jeneratörü DG8 Kartuş ve Contalar	Biyo-Rad	1864007
Problar için Damlacık Oluşturma Yağı	Biyo-Rad	1863005
Floresan problar (örn. FAM/HEX probları)	Sigma-Aldrich	Yok	Problar deneye özeldir ve mevcut herhangi bir sertifikalı satıcıdan satın alınabilir.
İleri ve Geri oligonükleotid primerleri	Sigma-Aldrich	Yok	Primerler deneye özeldir ve mevcut herhangi bir sertifikalı satıcıdan satın alınabilir.
ekipman
C1000 Dokunmatik Termal Döngüleyici	Biyo-Rad	1851148	Gradyan fonksiyonlu ve derin kuyulu diğer Thermo döngüleyiciyi kullanabilir

Serisi Gazetesi Gazetesi