Optimum Tavlama Sıcaklığını Belirlemek için Gradyan Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Özet

Kaynak: Tsujimoto, H. et al., Sivrisinek Aedes aegypti'de Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi Kullanılarak CRISPR/Cas9 Mutajenezini Takiben Indel Tespiti. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, kuyucuklar boyunca gradyan tavlama sıcaklığını ayarlayan primerlerin tavlama sıcaklığının optimizasyonu için gradyan polimeraz zincir reaksiyonunu göstermektedir. Farklı tavlama sıcaklıklarının etkisi, reaksiyon durumunu optimize etmeye yardımcı olan güçlendirilmiş ürünlerin verimi ile belirlenir.

Protokol

1. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), HRMA primer tasarımı ve primer validasyonu için tarama

1. Yabani tip laboratuvar koloni sivrisineklerinde SNP tanımlaması
   1. Uygun polipeptit translasyonunu bozmak için hedef ekzonu seçin.
      not: Hedef, başlangıç kodonuna yakın veya protein fonksiyonu için gerekli olan anahtar kalıntılar arasında olmalıdır. Ekzon ne kadar kısa olursa (örneğin, ≤200 baz), hedeflemek ve analiz etmek o kadar zor olur. Bir ekzonun sınırlarına yakın düzenleme yapmaktan kaçının, çünkü bu, HRMA primerlerinden birini ya bir intron'u geçmeye ya da bir intronun içinde olmaya zorlar. Bu istenmeyen bir durumdur çünkü SNP oranları bu bölgelerde çok daha yüksek olma eğilimindedir.
   2. Astar tasarımı
      1. NCBI Blast - Primer Blast web sitesine gidin, seçilen ekzonu kopyalayıp sayfanın üst kısmındaki kutuya yapıştırın | PCR ürün boyutunu seçin (ekzonun çoğunu kapsadığından emin olun) | organizmayı seçin.
      2. Gelişmiş parametreler | Seçin (PCR Ürünü TM için) ve 60 ekleyin (60 °C'lik optimum sıcaklık için) | Astarları alın. Diğer parametreleri varsayılan olarak tutun.
   3. Yabani tip laboratuvar kolonisinden genomik DNA (gDNA) elde edin. 10 sivrisineği bir kenara koyun, CO₂ ile uyuşturun ve etkisiz kalmaları için buz üzerinde bir Petri kabına koyun. DNA'nın dokudan salınması için 0,5 μL reaktif ve 20 μL seyreltme tamponu içeren 10 tüp kurun, her ikisi de Malzeme Tablosunda önerilen DNA salım kitinde sağlanır.
   4. Forseps kullanarak tek bir sivrisinekten bir bacağını çıkarın ve bacağını tamamen çözeltiye batırarak, seyreltilmiş bir DNA salım reaktifi çözeltisinin (adım 1.1.3'ten itibaren) karşılık gelen bir tüpüne yerleştirin. Bu adımı kalan sivrisineklerle tekrarlayın, bir sonrakine geçmeden önce forsepsleri% 70 etanol ile silin
   .
   5. Bacak içeren çözeltiyi oda sıcaklığında 2-5 dakika, ardından 98 °C'de 2 dakika inkübe edin ve PCR reaksiyonunu ayarlarken soğumasını bekleyin.
      not: Serbest bırakılan gDNA'yı içeren plakalar -20 °C'de saklanabilir ve bu noktada protokol duraklatılabilir.
   6. 10 μL 2x PCR Master Mix, 0,5 μM nihai konsantrasyona kadar primerler ve 20 μL'lik nihai hacme kadar moleküler dereceli su içeren 10 tüp hazırlayın ve seyreltilmiş numunenin 1 μL'sini her tüpe aktarın. Şu döngü parametrelerini izleyerek PCR gerçekleştirin: 98 °C 5 dakika, 5 saniye boyunca 98 °C'lik 40 döngü, 60 °C 30 saniye, 72 °C 20 saniye kb başına; 1 dakika boyunca 72 ° C'lik son uzatma.
   7. Artık PCR primerlerini bozmak ve fazla dNTP'leri veya herhangi bir kolon temizleme kitini fosforile etmek için PCR ürünlerini bir enzimle saflaştırın. Örnekleri sıralamaya devam edin.
   8. Her elektroferogramı çift tepelerin/belirsiz bazların varlığı açısından analiz edin ve uygun dejenere baz kodunu kullanarak her dizide baz çağrılarını manuel olarak ayarlayın.
      not: Bu adım, çoklu dizi hizalamasından önce gerçekleştirilmelidir, çünkü temel arama yazılımının "gerçek" temel çağrı olarak daha belirgin tepe noktasını seçmesi yaygın bir durumdur ve bu da SNP'lerin yokluğuna dair yanlış bir izlenim verir.
   9. Malzeme Tablosunda listelenen hizalama yazılımı SeqMan Pro'yu veya ClustalW veya T-Coffe gibi diğer açık kaynaklı hizalama yazılımlarını kullanarak çoklu sıralı hizalama gerçekleştirin.
      1. Hizalama yazılımını açın | Dizi Ekle'ye tıklayın | istediğiniz dizileri seçin ve Ekle'ye tıklayın | Tüm diziler seçildikten sonra Bitti'ye tıklayın.
      2. Hizalamayı gerçekleştirmek için Birleştir'e tıklayın. Hizalamayı açmak için Contig 1'e tıklayın ve hizalamayı analiz edin ve SNP'leri tanımlayın (Şekil 1).
         not: Adım 1.1.3-1.1.6'ya alternatif olarak, PCR, toplu örneklerden (>10 kişiden türetilen) elde edilen izole genomik DNA'dan gerçekleştirilebilir. Dizilenmiş amplikonlar, elektroferogramda çift tepe noktaları olarak görünen SNP'lerin varlığı için doğrudan analiz edilebilir, ancak nadir SNP'lerin tespit edilmesi daha zor olacaktır.
   10. 3-5 tek kılavuz RNA (sgRNA) tasarlayın, yukarıda tanımlanan herhangi bir SNP'yi içeren bölgelerden kaçınarak, aşağıda açıklanan protokolü izleyerek.

2. HRMA astar tasarımı

1. mFold kullanarak PCR sırasında olası ikincil yapı oluşumu için ekzon dizisini test edin.
   1. UNAFold Web Sunucusuna gidin | mFold'a tıklayın | açılır menüde Uygulamalar | DNA Katlama Formu.
   2. Kutuya sıra adını girin ve ekzonu yapıştırın.
   3. Katlama sıcaklığını 60 °C olarak değiştirin; İyonik koşullarda, [Mg ⁺⁺] değerini 1.5 olarak değiştirin ve Birimler üzerinde mM'ye geçin; DNA'yı Katla'ya tıklayın.
   4. Çıktıda, Yapı 1'in altında, Dairesel Yapı Çizimlerini açmak için pdf'ye tıklayın.
2. Astar tasarımı için NCBI Blast - Primer Blast'a gidin.
3. Adım 1.1'deki sıralama ile belirlenen seçili ekzon dizisini (en düşük sayıda SNP içeren veya hiç SNP içermeyen dizi) kopyalayıp sayfanın üst kısmındaki kutuya yapıştırın.
4. SNP'leri, hedef bölgeyi ve olası ikincil yapı oluşumu olan bölgeleri içeren dizileri işaretlemek ve hariç tutmak için < > sembolünü kullanın.
5. PCR ürün boyutunu 80 ile 150 bp arasında olacak şekilde seçin ve organizmayı seçin.
   not: Daha büyük parça boyutları başarıyla kullanılabilir (~ 300 bp). Bununla birlikte, daha uzun amplikonlar, bir veya sadece birkaç baz çiftinde farklılık gösteren diziler arasındaki hassasiyeti azaltabilir.
6. Primer Al'a tıklayın. Test edilecek 2-3 çift primer seçin (ideal olarak, primer bölgeleri herhangi bir CRISPR hedef bölgesinden ≥20-50 bp uzaktadır).

3. Astar doğrulaması

1. Tek bir bireyden gDNA kullanarak bir gradyan PCR gerçekleştirin.
   1. Bir ana karışım hazırlayın ve şablon olmayan kontrol (NTC) için bir numuneyi ayrı bir tüpte çıkarın. Şablonu kalan ana karışıma ekleyin ve 96 oyuklu bir plakaya alikot edin.
   2. Döngü parametrelerini takip edin: 98 °C 30 sn, 10 sn için 98 °C'lik 34 döngü, 55–65 °C 30 sn, 72 °C 15 sn; son uzatma 10 dakika boyunca 72 °C.
   3. Aşağıdaki parametrelere göre termal eriyik profilleri oluşturun: denatürasyon adımı 1 dakika boyunca 95 °C, 1 dakika boyunca 60 °C, 0,2 °C'lik artışlarla 75 °C ile 95 °C arasında erime eğrisi tespiti, her sıcaklıkta 10 sn bekletme süresi.
      not: Sadece tek bir termal eriyik profiline sahip tavlama sıcaklıkları kullanılmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1: SNP tanımlaması. Vahşi tipten AaeZIP11 parçasının çoklu dizi hizalamasının şematik gösterimi. Kırmızıda SNP'ler ve yeşilde SNP'lerden arınmış parçalar vardır; bu SNP içermeyen bölge, sgRNA ve primer tasarımı için önerilmektedir. Kısaltmalar: SNP = tek nükleotid polimorfizmi; sgRNA = tek kılavuz RNA; LVP = Liverpool suşu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 70 Etanol			Suda% 70 etanol çözeltisi
96 oyuklu PCR ve Gerçek zamanlı PCR plakaları	VWR (VWR)	82006-636	Genomik DNA elde etmek için (sivrisinek bacağından)
96 kuyulu plaka şablonları			Genotip kaydı için ev yapımı baskılı
Biyo Rad CFX96	Biyo Rad		Gradyan ve HRMA özelliklerine sahip PCR makinesi
Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji reaktif rezervuarları	VWR (VWR)	490006-896
Exo-CIP Hızlı PCR Temizleme Kiti	New England Biyolojik Laboratuvarları	E1050S Serisi
Cam Petri Kabı	VWR (VWR)	89001-246	150 mm x 20 mm
Nunc Poliolefin Akrilat Sızdırmazlık bandı, Thermo Scientific	VWR (VWR)	37000-548	Genomik DNA elde etmek için 96 oyuklu PCR plakaları ile kullanmak için
Phire Hayvan dokusu doğrudan PCR Kiti (numune alma araçları olmadan)	Termo Balıkçı	F140WH	Genomik DNA elde etmek ve PCR yapmak için
Hassas Eriyik Analiz Yazılımı	Biyo Rad	1845025	Sivrisinek DNA örneklerinin genotiplendirilmesi ve çift sarmallı DNA'nın termal denatürasyon özelliklerinin analiz edilmesi için kullanılır (bkz. protokol adımı 3.3)
Tek kanallı pipetleyici	Gilson
Phire Hayvan dokusu doğrudan PCR Kiti (numune alma araçları olmadan)	Termo Balıkçı	F140WH	Genomik DNA elde etmek ve PCR yapmak için
SeqMan Pro	DNAstar Lasergene yazılımı		Çoklu dizi hizalama için
Tek kanallı pipetleyici	Gilson

arası Serisi Serisi