Çift genetik belirteçlerin eş zamanlı olarak ölçülmesi için dubleks dijital PCR

Abstract

Kaynak: Cao, Y., et al. Enterococcus spp.'nin Eşzamanlı Kantitifikasyonu için Dubleks Dijital PCR Testi.ve Sularda İnsan Dışkısı ile ilişkili HF183 İşaretleyicisi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, iki farklı genetik belirteci aynı anda tespit etmede yararlı olan geleneksel PCR tekniğinin bir modifikasyonu olan çift yönlü dijital PCR (ddPCR) tekniğini gösteriyoruz. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız olarak amplifiye edilen nanolitre boyutunda emülsifiye edilmiş damlacıklara bölünür ve hedef dizilerin başlangıç konsantrasyonunu hesaplamak için damlacıkların fraksiyonundan farklı renkli floresan amplifikasyon sinyallerinin tespiti kullanılır.

Protocol

1. Tahlil Karışımı Hazırlama

1. Moleküler dereceli sudaki tüm primerler ve TE pH 8 tamponundaki problar için 100 μmol / L stok konsantrasyonları yapın [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   NOT: İki hedef için problar, Malzeme/Ekipman Listesinde belirtildiği gibi farklı floroforlarla floresan olarak etiketlenmiştir.
2. Planlanan reaksiyon başına 12 μl dijital PCR karışımı (2x stok, Malzeme/Ekipman Listesine bakınız), her biri 0.216 μl ileri ve geri astar, her biri 0.06 μl floresan prob ve 5.016 μl nükleaz içermeyen su (nihai konsantrasyon: her primer için 900 nM, her prob için 250 nM) karıştırarak ana karışımı hazırlayın. Solüsyona hava kabarcıkları girmemesine dikkat ederken karıştırmak için en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
3. Damlacık üretimi için bir tahlil karışımı yapmak üzere 6 μl DNA şablonunda (daha önce açıklandığı gibi ekstrakte edilmiş) karıştırarak 18 μl ana karışımı (adım 1.2'den itibaren) normal bir PCR tüpüne veya plakasına pipetleyin. Numuneleri iki parça halinde çalıştırıyorsanız, her bir oyuğa 36 μl ana karışım ve 12 μl DNA şablonu pipetleyin. İlgili çoğaltma kuyularını plaka üzerinde boş bırakın. Pozitif kontrolleri dahil edin (Malzemeler/Ekipman Listesine bakın) ve şablon kontrolleri yok (NTC) (yani şablon olarak kullanılan moleküler dereceli su ile).
   not: Testin düzgün çalıştığından emin olmak için pozitif kontrol gereklidir ve plaka içinde kontaminasyon olmadığından emin olmak ve daha sonra veri analizinde floresan taban çizgisini ayarlamak için NTC gereklidir. İlk kez kullananların hem seyreltilmemiş hem de seyreltilmiş DNA örneklerini kullanmaları önerilir.

2. Damlacık Üretimi ve PCR Plakası Kurulumu

1. Çok kanallı bir pipet kullanarak yaklaşık 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek tahlil karışımlarını karıştırın. Karışımda fazla kabarcık oluşmasını önlemek için pipet ucunun sıvının içinde kaldığından emin olun.
2. Kartuş 1'i (8 kuyu içeren) beyaz bir kartuş tutucuya yerleştirin ve kartuş tutucuyu tıklatarak kapatın. Kartuş 1 artık sıkıca yerine oturmuştur ve damlacıklar oluştururken tutucudan çıkarılamaz. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 20 μl tahlil karışımını hava kabarcıkları oluşturmadan 'Örnek' olarak işaretlenmiş kartuşun orta konumuna nazikçe aktarın.
3. Kartuşun sol tarafına 70 μl damlacık oluşturma yağı pipetleyin ('Yağ' olarak işaretlenmiştir).
4. Kartuşu bir contayla örtün, contanın düz olduğundan ve kartuşun kenarına doğru 4 kene tarafından eşit şekilde tutulduğundan emin olun. Kartuşu açmak ve yerleştirmek için damlacık üreteci üzerindeki yeşil ışıklı düğmeye basın. Jeneratörü kapatmak için yeşil ışıklı düğmeye tekrar basın.
   not: Kapı kapandıktan sonra düğme kısılır, kapı tekrar açılamaz ve damlacık oluşumu hemen başlar ve yaklaşık 1 dakika devam eder.
5. 8'den fazla reaksiyon yapıyorsanız, kartuş 2'yi ikinci bir beyaz kartuş tutucuya yerleştirin ve toplam kurulum süresinden tasarruf etmek için damlacık üretimi devam ederken kartuş 1 ile aynı şekilde hazırlayın.
6. Loş ışıklı düğme yeşile dönerek damlacık oluşumunun tamamlandığını gösterdiğinde damlacık üreteci kapısını açın. Kartuş 1'i içeren beyaz kartuş tutucuyu çıkarın, bir kenara koyun ve kartuş 2'yi damlacık üretecinin üzerine yerleştirin.
7. Contayı kartuş 1'den çıkarın ve atın. Kartuşun üçüncü sütunundan ('Damlacıklar' olarak işaretlenmiş) üretilen damlacıkların toplam hacmini (yaklaşık 40 μl) termal döngü için son bir PCR plakasına (oda sıcaklığında tutulur) nazikçe aktarın.
   not: Eylem yeni oluşan damlacıkları kırabileceğinden beyaz kartuş tutucunun işaretini çıkarmayın; Kartuş tutucuyu ancak damlacıklar son plakaya aktarıldıktan sonra açın.
8. Ek örnekler için 2.1-2.7 adımlarını tekrarlayın.
9. Tüm damlacıklar son PCR plakasında olduğunda, plakanın üzerine delinebilir bir folyo kapak yerleştirin ve bir plaka kapatıcı üzerine yerleştirin. Kapatıcıyı 180 °C'ye ayarlayın, kapatıcı üzerindeki 'Oynat'a basın ve 10 saniye boyunca sızdırmazlığa izin verin.

3. Termal Döngü ve Damlacık Okuma

1. Sızdırmaz plakayı, adım 2.7'de kullanılan son PCR plakasıyla uyumlu ve 2.0 °C/sn'lik bir sıcaklık rampa hızı olan termal döngüleyiciye yerleştirin.
2. Termal programı şu şekilde çalıştırın: 95 °C'de 10 dakika, ardından 94 °C'de 30 saniyelik 40 döngü ve 60 °C'de 60 saniye, ardından 98 °C'de 10 dakikalık tutma (isteğe bağlı: 4 veya 15 °C'de son tutma).
3. Döngü tamamlandıktan sonra, her bir oyuktaki her damlacıktaki floresansın otomatik ölçümü için plakayı bir Damlacık Okuyucuya aktarın. Alternatif olarak, damlacık okumasından önce plakayı 4 °C'de 3 güne kadar saklayın. Okumaya devam etmeden önce damlacıkların oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
   1. Damlacık okumasını ayarlamak için birlikte verilen yazılımı açın. Boş bir 96 kuyulu plakanın şemasını içeren varsayılan 'Kurulum' menüsünde, üç bölüm içeren menüyü açmak için A1 kuyusuna çift tıklayın: 'Örnek', 'Tahlil 1' ve 'Test 2'.
   2. 'Örnek' bölümünde, 'Ad' etiketli kutuya örnek kimliğini yazın ve enter tuşuna basın veya sağdaki 'Uygula' işaretli kutuyu işaretleyin. Ardından, 'Deney' etiketli açılır menüyü tıklayın ve 'KIRMIZI'yı (nadir olay algılama) seçin ve enter'a tıklayın.
   3. 'Test 1' ile gösterilen bölüme geçin. 'Ad' bölümünde testi doldurun (örneğin Enterococcus) ve enter'a tıklayın. 'Tür' etiketli aşağıdaki kutuda açılır menüyü tıklayın ve 'Kanal 1 Bilinmeyen'i seçin ve enter'a tıklayın.
   4. 'Test 2' ile gösterilen bölüme geçin. 'Ad' bölümünde testi doldurun (ör. HF183) ve enter'a tıklayın. 'Tür' etiketli aşağıdaki kutuda açılır menüyü tıklayın ve 'Kanal 2 Bilinmeyen'i seçin ve enter'a tıklayın. Adım 3.3.2'den 3.3.4'e kadar olan tüm bilgiler artık A1 kuyusunda mevcuttur.
   5. Damlacıklar içeren sonraki tüm kuyuları adlandırın. Toplam kurulum süresinden tasarruf etmek için, aynı anda birden fazla kuyu seçmek için 'Shift' veya 'Ctrl'ye tıklayın.
   6. Plakanın dijital tasviri fiziksel plakayı yansıttığında, menünün sağ alt kısmındaki 'Tamam'a basın. Plaka şemasının üst kısmında görünen yeni menüde, 'Şablon' bölümünün altında 'Farklı Kaydet'i seçin ve plakayı adlandırın ve kaydedin.
   7. Ekranın solundaki 'Çalıştır'ı tıklayın ve açılan "Çalıştırma Seçenekleri" penceresinde uygun Boya Ayarını seçin. Veri toplama başlatılır ve yazılımda gerçek zamanlı olarak görüntülenir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Düşük Bağlayıcı Mikrotüpler	Yardımcı yıldız	3207	Reaktiflerin depolanması, numuneler/ana karışımların üretimi için
Nükleaz İçermeyen Su	Balıkçı Bilimi	BP2484-50
TE pH 8 tamponu	Balıkçı Bilimi	BP2473-100
Sert Kabuklu 96 Kuyulu Plaka	BioRad (BiyoRad	HSP-9601	İlk ana karışım ve numune aşılaması için
Alüminyum Sızdırmazlık Filmi	BioRad (BiyoRad	359-0133	Numune plakasını kapatmak için
Damlacık Jeneratörü	BioRad (BiyoRad	186-3002
Damlacık Üretimi Yağı	BioRad (BiyoRad	186-3005
fişek	BioRad (BiyoRad	186-4008
DG8 Kartuş Tutucu	BioRad (BiyoRad	186-3051
conta	BioRad (BiyoRad	186-3009
20 uL pipet uçları	Yağmur	GP-L10F	Numune / ana karışımı kartuşa tansferring için
200 uL pipet uçları	Yağmur	GP-L200F	Damlacıkların son Twin.Tec Plakasına aktarılması için
Twin.Tec 96 Kuyulu Plaka	Eppendorf Belediyesi	951020320	Son damlacıklar için termal döngü ve okuma
Delinebilir Isı Yalıtım Folyosu	BioRad (BiyoRad	181-4040	Termal döngüden önce Twin.Tec plakasını kapatmak için
PX1 PCR Plaka Kapatıcı	BioRad (BiyoRad	181-4000	Sadece termal döngüleyiciye ihtiyaç vardır, optik yoktur
CFX96 Termal döngüleyici	BioRad (BiyoRad	CFX96 ve C1000
QX100 Damlacık Okuyucu	BioRad (BiyoRad	186-3001
Damlacık Okuyucu Yağı	BioRad (BiyoRad	186-3004
Damlacık PCR Süper Karışımı	BioRad (BiyoRad	186-3024	yani el yazmasındaki dijital PCR karışımı
QuantaSoft yazılımı (v1.3.2)	Quantasoft Belediyesi	QX100	ddPCR verilerini görüntülemek, analiz etmek ve dışa aktarmak için
Entero İleri Astar (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternatif satıcı kullanılabilir
Entero Ters Astar (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternatif satıcı kullanılabilir
Entero Sondası (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG, TTC, TCT, CCG, AAA, ETIKET, CTT, ETIKET, GGC, TA-[BHQ1]	Alternatif satıcı kullanılabilir, ancak floroforun FAM olması gerekir
HF183 İleri Astar (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternatif satıcı kullanılabilir
HF183 Ters Astar (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternatif satıcı kullanılabilir
HF183 Probu (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Alternatif satıcı kullanılabilir, ancak floroforun HEX olması gerekir (VIC kullanılıyorsa, uygun matris telafisi seçilmelidir.)
Pozitif kontrol			E.faecalis genomik DNA ve HF183 standart plazmid karışımı (IDT'den sipariş edilir). E. faecalis'in kültürlenmesinde ayrıntılı yöntemler ve sipariş edilen HF183 plazmidinin dizileri için lütfen Cao ve ark. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Ticari olarak mevcut Enterococcus DNA standartları (ATCC 29212Q-FZ), laboratuvarda hazırlanmış E. faecalis genomik DNA'nın yerine pozitif kontrolde de kullanılabilir.