1. Tahlil Karışımı Hazırlama
- Moleküler dereceli sudaki tüm primerler ve TE pH 8 tamponundaki problar için 100 μmol / L stok konsantrasyonları yapın [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
NOT: İki hedef için problar, Malzeme/Ekipman Listesinde belirtildiği gibi farklı floroforlarla floresan olarak etiketlenmiştir.
- Planlanan reaksiyon başına 12 μl dijital PCR karışımı (2x stok, Malzeme/Ekipman Listesine bakınız), her biri 0.216 μl ileri ve geri astar, her biri 0.06 μl floresan prob ve 5.016 μl nükleaz içermeyen su (nihai konsantrasyon: her primer için 900 nM, her prob için 250 nM) karıştırarak ana karışımı hazırlayın. Solüsyona hava kabarcıkları girmemesine dikkat ederken karıştırmak için en az 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Damlacık üretimi için bir tahlil karışımı yapmak üzere 6 μl DNA şablonunda (daha önce açıklandığı gibi ekstrakte edilmiş) karıştırarak 18 μl ana karışımı (adım 1.2'den itibaren) normal bir PCR tüpüne veya plakasına pipetleyin. Numuneleri iki parça halinde çalıştırıyorsanız, her bir oyuğa 36 μl ana karışım ve 12 μl DNA şablonu pipetleyin. İlgili çoğaltma kuyularını plaka üzerinde boş bırakın. Pozitif kontrolleri dahil edin (Malzemeler/Ekipman Listesine bakın) ve şablon kontrolleri yok (NTC) (yani şablon olarak kullanılan moleküler dereceli su ile).
not: Testin düzgün çalıştığından emin olmak için pozitif kontrol gereklidir ve plaka içinde kontaminasyon olmadığından emin olmak ve daha sonra veri analizinde floresan taban çizgisini ayarlamak için NTC gereklidir. İlk kez kullananların hem seyreltilmemiş hem de seyreltilmiş DNA örneklerini kullanmaları önerilir.
2. Damlacık Üretimi ve PCR Plakası Kurulumu
- Çok kanallı bir pipet kullanarak yaklaşık 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek tahlil karışımlarını karıştırın. Karışımda fazla kabarcık oluşmasını önlemek için pipet ucunun sıvının içinde kaldığından emin olun.
- Kartuş 1'i (8 kuyu içeren) beyaz bir kartuş tutucuya yerleştirin ve kartuş tutucuyu tıklatarak kapatın. Kartuş 1 artık sıkıca yerine oturmuştur ve damlacıklar oluştururken tutucudan çıkarılamaz. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 20 μl tahlil karışımını hava kabarcıkları oluşturmadan 'Örnek' olarak işaretlenmiş kartuşun orta konumuna nazikçe aktarın.
- Kartuşun sol tarafına 70 μl damlacık oluşturma yağı pipetleyin ('Yağ' olarak işaretlenmiştir).
- Kartuşu bir contayla örtün, contanın düz olduğundan ve kartuşun kenarına doğru 4 kene tarafından eşit şekilde tutulduğundan emin olun. Kartuşu açmak ve yerleştirmek için damlacık üreteci üzerindeki yeşil ışıklı düğmeye basın. Jeneratörü kapatmak için yeşil ışıklı düğmeye tekrar basın.
not: Kapı kapandıktan sonra düğme kısılır, kapı tekrar açılamaz ve damlacık oluşumu hemen başlar ve yaklaşık 1 dakika devam eder.
- 8'den fazla reaksiyon yapıyorsanız, kartuş 2'yi ikinci bir beyaz kartuş tutucuya yerleştirin ve toplam kurulum süresinden tasarruf etmek için damlacık üretimi devam ederken kartuş 1 ile aynı şekilde hazırlayın.
- Loş ışıklı düğme yeşile dönerek damlacık oluşumunun tamamlandığını gösterdiğinde damlacık üreteci kapısını açın. Kartuş 1'i içeren beyaz kartuş tutucuyu çıkarın, bir kenara koyun ve kartuş 2'yi damlacık üretecinin üzerine yerleştirin.
- Contayı kartuş 1'den çıkarın ve atın. Kartuşun üçüncü sütunundan ('Damlacıklar' olarak işaretlenmiş) üretilen damlacıkların toplam hacmini (yaklaşık 40 μl) termal döngü için son bir PCR plakasına (oda sıcaklığında tutulur) nazikçe aktarın.
not: Eylem yeni oluşan damlacıkları kırabileceğinden beyaz kartuş tutucunun işaretini çıkarmayın; Kartuş tutucuyu ancak damlacıklar son plakaya aktarıldıktan sonra açın.
- Ek örnekler için 2.1-2.7 adımlarını tekrarlayın.
- Tüm damlacıklar son PCR plakasında olduğunda, plakanın üzerine delinebilir bir folyo kapak yerleştirin ve bir plaka kapatıcı üzerine yerleştirin. Kapatıcıyı 180 °C'ye ayarlayın, kapatıcı üzerindeki 'Oynat'a basın ve 10 saniye boyunca sızdırmazlığa izin verin.
3. Termal Döngü ve Damlacık Okuma
- Sızdırmaz plakayı, adım 2.7'de kullanılan son PCR plakasıyla uyumlu ve 2.0 °C/sn'lik bir sıcaklık rampa hızı olan termal döngüleyiciye yerleştirin.
- Termal programı şu şekilde çalıştırın: 95 °C'de 10 dakika, ardından 94 °C'de 30 saniyelik 40 döngü ve 60 °C'de 60 saniye, ardından 98 °C'de 10 dakikalık tutma (isteğe bağlı: 4 veya 15 °C'de son tutma).
- Döngü tamamlandıktan sonra, her bir oyuktaki her damlacıktaki floresansın otomatik ölçümü için plakayı bir Damlacık Okuyucuya aktarın. Alternatif olarak, damlacık okumasından önce plakayı 4 °C'de 3 güne kadar saklayın. Okumaya devam etmeden önce damlacıkların oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
- Damlacık okumasını ayarlamak için birlikte verilen yazılımı açın. Boş bir 96 kuyulu plakanın şemasını içeren varsayılan 'Kurulum' menüsünde, üç bölüm içeren menüyü açmak için A1 kuyusuna çift tıklayın: 'Örnek', 'Tahlil 1' ve 'Test 2'.
- 'Örnek' bölümünde, 'Ad' etiketli kutuya örnek kimliğini yazın ve enter tuşuna basın veya sağdaki 'Uygula' işaretli kutuyu işaretleyin. Ardından, 'Deney' etiketli açılır menüyü tıklayın ve 'KIRMIZI'yı (nadir olay algılama) seçin ve enter'a tıklayın.
- 'Test 1' ile gösterilen bölüme geçin. 'Ad' bölümünde testi doldurun (örneğin Enterococcus) ve enter'a tıklayın. 'Tür' etiketli aşağıdaki kutuda açılır menüyü tıklayın ve 'Kanal 1 Bilinmeyen'i seçin ve enter'a tıklayın.
- 'Test 2' ile gösterilen bölüme geçin. 'Ad' bölümünde testi doldurun (ör. HF183) ve enter'a tıklayın. 'Tür' etiketli aşağıdaki kutuda açılır menüyü tıklayın ve 'Kanal 2 Bilinmeyen'i seçin ve enter'a tıklayın. Adım 3.3.2'den 3.3.4'e kadar olan tüm bilgiler artık A1 kuyusunda mevcuttur.
- Damlacıklar içeren sonraki tüm kuyuları adlandırın. Toplam kurulum süresinden tasarruf etmek için, aynı anda birden fazla kuyu seçmek için 'Shift' veya 'Ctrl'ye tıklayın.
- Plakanın dijital tasviri fiziksel plakayı yansıttığında, menünün sağ alt kısmındaki 'Tamam'a basın. Plaka şemasının üst kısmında görünen yeni menüde, 'Şablon' bölümünün altında 'Farklı Kaydet'i seçin ve plakayı adlandırın ve kaydedin.
- Ekranın solundaki 'Çalıştır'ı tıklayın ve açılan "Çalıştırma Seçenekleri" penceresinde uygun Boya Ayarını seçin. Veri toplama başlatılır ve yazılımda gerçek zamanlı olarak görüntülenir.
