1. Mikro Hacimli Spektrofotometre Kullanarak RNA'nın Miktarının Belirlenmesi
- Spektrofotometrenin ayarlarının RNA olarak ayarlandığından emin olun.
- Makineyi başlatmak ve bir referans değer belirlemek için 1-2 μL moleküler dereceli su kullanın.
- RNA miktarını değerlendirmek için her test RNA örneğinden 1-2 μL kullanın.
- Okumaları ve belgeyi kaydedin.
- Gerekirse RNA'yı 1 μg/μL'ye ayarlayın.
not: RNA her zaman buz üzerinde (veya serin bir blokta) tutulmalıdır. RNA, bir kolon veya boncuk bazlı yöntem kullanılarak elde edilirse, RNA genellikle 1 μg/μL'den azdır. Bu durumda, RNA'yı temiz kullanın.
2. Uç Nokta Hassasiyetini Belirlemek için RNA Seyreltme Serilerinin Hazırlanması
- RNA'nın 10 kat seri seyreltmesini yapın.
- Tüpleri seyreltme serisi (örneğin, 10-1, 10-2, vb.) ve RNA detayları ile etiketleyin.
- Her tüpe 45 μL moleküler dereceli su ekleyin.
- 5 μL RNA ekleyin (önceden 1 μg/μL'ye seyreltilmişti) ve iyice karıştırın.
- Pipet ucunu uygun dezenfektana atın ve yeni bir uçla değiştirin.
- 10-1'den 5 μL alın ve 10-2 tüpe ekleyin ve iyice karıştırın.
- Kalan seyreltmelerle 2.1.3-2.1.5'i tekrarlayın.
NOT: RNA her zaman buz üzerinde (veya soğuk bir blokta) tutulmalıdır.
3. Gerçek Zamanlı RT-PCR Reaksiyonlarının Hazırlanması
- Bir elektronik tablo kullanarak, hem lizsavirüs hem de ß-aktin tahlilleri için test numunelerinin ve kontrol numunelerinin sayısına göre plaka düzenini planlayın.
not: 4 numune, pozitif ve negatif kontrol ile iki kez test edilecekse, bu, her iki test için de 10 reaksiyona eşittir.
- 'Temiz odada' veya RNA şablonundan ayrı bir alanda, kullanmadan önce yüzeyleri uygun bir dezenfektanla silin veya bir PCR iş istasyonu hazırlayın (kullanılıyorsa). İş istasyonunu hazırlamak için dolap yüzeyini uygun bir dezenfektan ile silin ve gerekli eşyaları iş istasyonuna yerleştirin ve kapıları kapatın. UV ışığını 10 dakika boyunca açın.
- Regentleri ve astarları dondurucudan çıkarın ve çözün (Tablo 1'de listelenen reaktifler ve Tablo 2'deki primerler).
NOT: Enzim karışımı gliserol içinde saklanır, bu nedenle çözülmesi gerekmez ve her zaman buz üzerinde (veya serin bir blokta) tutulmalıdır. Diğer tüm reaktifler oda sıcaklığında çözülebilir.
- Çözüldükten sonra, sıvıyı toplamak için reaktifleri karıştırın ve kısa bir süre santrifüjleyin.
NOT: Enzim karışımını girdaplamayın, sadece kısa bir süre santrifüjleyin.
- Lyssavirus ve ß-aktin için ayrı ana karışımlar hazırlayın. Her reaksiyon için 7.55 μL moleküler dereceli su, 10 μL 2x Universal SYBR yeşil reaksiyon karışımı, 0.6 μL ileri astar, 0.6 μL ters astar, 0.25 μL iTaq RT enzim karışımı ekleyin.
- Manuel hesaplamada hatalardan kaçınmak için doğru hacimleri hesaplamak için bir elektronik tablo kullanın. Pipetleme hatalarını telafi etmek için yeterli ana karışımın hazırlandığından emin olun. Bu nedenle, 10 reaksiyon gerekiyorsa (3.1'deki NOT'a bakınız), 12 reaksiyon hazırlayın
- Ana karışımı buz üzerinde (veya soğuk bir blokta) hazırlayın ve gerçek zamanlı makineye yerleştirilene kadar buz üzerinde kalın.
- Hazırlanan ana karışımları karıştırın, kısa bir süre santrifüjleyin ve 19 μL'yi ilgili şerit tüpleri kuyucuklarına veya kullanılan gerçek zamanlı makineyle uyumlu 96 oyuklu bir plakaya dağıtın.
NOT: Pipetleme sırasında kuyucuklarda kabarcık oluşumunu en aza indirin.
- Ayrı bir odada veya 3.2'de tarif edildiği gibi hazırlanmış bir UV kabininde, daha önce 1 μg/μL'ye ayarlanmış 1 μL RNA'yı (bkz. adım 1.5) uygun ana karışım kuyusunun yüzeyinin altına dikkatlice ekleyin ve hafifçe karıştırın. Pipet ucunu kullandıktan hemen sonra (yüzeyin altına) dezenfektana atın.
- Kontrolleri test numunelerinden sonra ekleyin, daha sonra pozitif kontrol eklendi ve en son şablonsuz kontrol (NTC – moleküler dereceli su) eklendi. Kullanılan RNA miktarı, numune tipine ve kullanılan RNA ekstraksiyonuna bağlı olarak değiştirilebilir. Reaksiyonun optimize edildiğinden emin olmak için kullanılan miktar doğrulanmalıdır.
- Plakayı şerit kapaklar veya sızdırmazlık maddesi kullanarak kapatın, tüm kapakların sıkıca kapatıldığından ve numuneleri yönlendirmek için yeterince etiketlendiğinden emin olun. Plaka/şerit tüplerinin kenarını etiketleyin.
- Kuyuların dibindeki tüm sıvıyı toplamak için bir santrifüj kullanarak numuneleri döndürün.
- Plakayı gerçek zamanlı PCR makinesine aktarın, kapıyı açın ve numunelerin plaka düzenine göre doğru konumunu/yönünü sağlayarak tutucuya yerleştirin.
NOT: Tüp şeritleri kullanılıyorsa, tutucunun yerinde olduğundan emin olun.
- Gerçek zamanlı PCR makine programını açın ve ayrışma eğrisi ile SYBR gerçek zamanlı deney seçeneğini seçin. Veri toplama noktaları da dahil olmak üzere Tablo 3'te belirtilen termal döngü koşullarını kullanarak gerçek zamanlı PCR makinesini programlayın.
- Floresan boya olarak SYBR'yi seçin ve numune türü olarak bilinmeyen'i seçin ve doğru numune adı kutusuna bir ad girin.
not: Replikatlar arasında ve ayrıca lyssavirus ve ß-aktin kuyuları arasında ayrım yapın.
- Deneysel verileri kaydetmek için bir dosya konumu seçin, çalışmanın sonunda lambanın kapanacağından emin olun, ardından çalışmayı başlatın.
NOT: İlk adım bir RT aşaması olduğundan, bu süre zarfında herhangi bir veri toplanmaz, bu nedenle, lamba bir ısınma süresi gerektiriyorsa, bu RT aşaması sırasında meydana gelebilir. Gerçek zamanlı makine ve yazılım, amplifikasyon eğrilerini gerçek zamanlı olarak gösterecek, erime eğrisi ise döngünün sonunda oluşturulacaktır.
