$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. FFPE Dokusu, Periferik Kan ve Kemik İliği Aspiratından DNA Ekstraksiyonu
- DNA FFPE ekstraksiyon kiti ile kemik iliği FFPE dokusu için
- Lekesiz slaytlardan (5 - 10 μm kalınlığında 5 - 10 bölüm) FFPE dokusu ile başlayın.
not: Doku talaşı ile başlıyorsanız, 5 - 10 μm kalınlığında 3 - 6 bölüm kullanın ve adım 1.1.6'ya atlayın.
- Slaytları bir sürgülü sepete yerleştirin ve dört yıkama haznesi hazırlayın (ikisi Ksilen için ve ikisi %100 Alkol için). Her sepete en az 600 mL çözelti ekleyin.
- İlk tepside 5 dk ksilen yıkama yaparak slaytları deparafinize edin. Slaytları 5 dakika daha ikinci ksilen yıkama haznesine aktarın.
- Deparafinizasyondan sonra slaytları 5 dakika boyunca %100 alkolle yıkayın. Slaytları 5 dakika daha ikinci alkollü yıkama haznesine aktarın.
- Slaytları bir tıraş bıçağıyla bir mikrosantrifüj tüpüne kazımadan önce bir kaputun altında tamamen kurumasını bekleyin.
not: Belirtilen tümör bölgesine sahip bir H&E lamı mevcutsa, slaytları hizalayın ve sadece tümör bölgesini kazıyın.
- Kitte bulunan üretici broşüründeki talimatlarla devam edin.
- BM aspirat ve Periferik Kan için
- Bu özelliklerle birlikte üreticinin talimat broşürüne göre çıkarın.
not: FFPE dokularından ve hücrelerinden DNA ekstraksiyonu için ticari olarak temin edilebilen çok sayıda kit ve yöntem vardır. Pratik olarak, hepsi kullanılabilir. Laboratuvarda belirlenmiş bir yöntemi kullanın.
- 200 μL periferik kan (PB) veya 100 μL BM + 100 μL PBS kullanın.
- 4 μL RNase A stok çözeltisi kullanın.
- 100 μL elüsyon tamponu ile elute.
- DNA miktar tayini
- 260 nm/280 nm oranının yaklaşık 1,8 olmasını sağlayan bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonlarını ölçün (saf DNA için). Oran önemli ölçüde düşükse, aşağı akış uygulamalarına müdahale edebilecek protein, fenol veya diğer kirleticilerin varlığını gösterebilir.
- Uygun elüsyon tamponu ile DNA konsantrasyonlarını yaklaşık 50 - 100 ng / μL'ye ayarlayın.
2. Vahşi Tip Engelleme PCR
- Astar Tasarımı
- PCR primer tasarımının daha önce açıklanan genel yönergelerine göre ilgilenilen genler için primerler tasarlayın ve elde edin. PCR primerlerine M13 ileri ve geri evrensel sıralama primerlerini dahil edin.
not: MYD88 testi, MYD88'in ekzon 5'ini (G259 - N291) ve 5' intronik bölgede bulunan 110 nükleotidi, ekleme bölgesini ve intron 4'ün bir kısmını kapsayacak şekilde amplifiye etmek için geliştirilmiştir. İleri ve geri primerler 5'-M13 dizisi ile tasarlanmıştır (M13- ileri: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-ters: cag gaa aca gct atg acc) tamamlayıcı sıralama astarlarının tavlanmasına izin vermek için (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Kilitli Nükleik Asit Oligonükleotid Tasarımı
- Bloke edici oligonükleotidi yaklaşık 10 - 15 baz uzunluğunda olacak ve mutant zenginleştirmenin istendiği WT şablonunu tamamlayacak şekilde tasarlayın.
not: Daha kısa bir oligo, uyumsuzluk ayrımcılığını iyileştirecektir. Yüksek hedef özgüllüğü elde etmek için, çok fazla bloke edici nükleotid kullanmamak önemlidir, çünkü bu çok "yapışkan" bir oligonükleotid ile sonuçlanabilir. İçerik, uzunluk ve bloke edici nükleotid, bloke edilmesi gereken spesifik nükleotidi göre optimize edilmelidir. İkincil yapıdan ödün vermeden ve kendi kendini tamamlama riskini almadan yüksek bağlanma özgüllüğü elde etmek önemlidir.
- Blokaj oligosunu, termodöngü sırasında uzatma sıcaklığının 10 - 15 ° C üzerinde bir Tm değerine sahip olacak şekilde tasarlayın. Bloke edici bazlar ekleyerek veya çıkararak veya DNA için bloke edici bazları ikame ederek ve aynı zamanda bloke edici G veya C bazlarının uzun gerilmelerinden (3 - 4 baz) kaçınarak TM'yi ayarlayın.
- Oligo araçları web sitesine gidin (Malzeme Tablosuna bakın) ve "Oligo Tm Tahminini Engelleme" aracını seçin.
- Engellenmesi istenen WT şablonunun sırasını "Oligo Sırası" kutusuna yapıştırın. Engelleyici tabanları belirtmek için tabanların önüne "+" ekleyin.
- DNA-Bloker hibritinin yaklaşık Tm'sini belirlemek için "Hesapla" düğmesini seçin.
- İkincil yapı oluşumunu veya kendi kendine dimerleri önlemek için bloke edici oligo'yu tasarlayın.
- Oligo araçları web sitesine gidin (Malzeme Tablosuna bakın) ve "Oligo Optimizer'ı engelleme" aracını seçin.
- Engellenmek istenen WT şablonunun sırasını kutuya yapıştırın. Engelleme tabanlarını belirtmek için tabanların önüne "+" ekleyin.
- "İkincil Yapı" ve "Yalnızca Öz" için iki kutuyu seçin. Oligo'yu potansiyel olarak zahmetli ikincil yapılar veya kendi kendine dimerler için gözden geçirmek için Analiz düğmesine basın.
not: Skorlar, ikincil yapıların ve öz dimerlerin Tm'lerinin çok kaba tahminlerini temsil eder. Bu nedenle daha düşük puanlar optimaldir ve bloker-bloker eşleştirmesini sınırlayarak elde edilebilir. MYD88 için bloke edici oligonükleotid [MYD88 blokeri (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + A + CC / invdT /)] Q262-I266 amino asitlerini kapsayacak şekilde tasarlanmıştır ve DNA polimeraz tarafından her iki uzantıyı ve 3'-eksonükleaz ile bozunmayı inhibe etmek için 3' ters çevrilmiş bir dT'ye sahiptir. Bu spesifik blokaj oligosu, "+N" olarak gösterilen 10 blokaj tabanına sahip bir 17 mer'dir. Kalan 7 baz sıradan DNA nükleotidleridir.
- WTB-PCR Kurulumu ve Termosiklasyon
- 2.5 μL PCR reaksiyon tamponu 10x w/ 20 mM MgCl2, 250 μM dNTP'ler, 0.2 μM ileri ve geri astar, 1.2 μM MYD88 bloker ve reaksiyon başına 21.75 μL'lik bir nihai çözelti hacmi oluşturmak için DNAse, RNAse-free, ultra saf H2Okullanarak bir WTB-PCR ana karışımı (MMX) hazırlayın.
not: Çalışma konsantrasyonları, 25 μL'lik son reaksiyon hacmi içindir (DNA şablonu ve polimerazın eklenmesinden sonra). Konvansiyonel PCR MMX, bir blokerin eklenmesi ihmal edilerek hazırlanır. Tüm protokol adımları hem WTB hem de konvansiyonel PCR için aynı kalır. Bu, bir engelleyicinin eklenmesiyle elde edilen zenginleştirmenin doğrulanmasında ve belirlenmesinde kullanılabilir.
- Hazırlanacak MMX miktarını hesaplarken, 3 ek reaksiyonu (pozitif ve negatif kontroller ve kontaminasyonu kontrol etmek için şablon olmayan bir kontrol) ve pipetleme hatası için en az 1 ek reaksiyonu hesaba kattığınızdan emin olun.
- MMX'i iyice girdaplayın. MMX -80 °C'de bir yıla kadar saklanabilir.
- MMX'e reaksiyon başına 0.25 μL Taq DNA polimeraz ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Polimeraz MMX'e eklendikten sonra, buz üzerinde tutun.
- Soğuk bir plakaya yeni bir 96 oyuklu PCR plakası koyun ve her reaksiyon kuyucuğuna polimeraz ile 22 μL MMX pipetleyin.
- Polimeraz ile MMX içeren oyukların her birine 3 μL genomik DNA (50 - 100 ng / μL) ekleyin.
- Çözeltinin her bir kuyucuğun dibine ulaştığından emin olmak için plakayı kapatın ve kısa bir süre santrifüjleyin.
- PCR plakasını bir termocycler'a yükleyin.
- WTB-PCR reaksiyonu için termodöngü koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 95 ° C'de 6 dakika boyunca ilk denatürasyon; 30 saniye boyunca 95 ° C'de 40 döngü denatürasyon, 30 saniye boyunca 56 ° C'de astar tavlama ve 1 dakika 20 saniye boyunca 72 ° C'de uzatma; son uzatma 72 ° C'de 10 dakika < br />
not: En iyi uygulama, gelecekteki kurulumlarda amplikon kontaminasyonunu önlemek için protokolün geri kalanını fiziksel olarak ayrı bir alanda tamamlamayı içerir.