$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. qPCR reaksiyonlarını hazırlayın
>NOT: Bir PCR reaksiyonu bir numune içindir. Her PCR reaksiyonu, 5 μL qPCR ana karışımı (malzemelere bakınız), 1 μL 5 μM primer çift karışımı, 2 μL H2O ve 2 μL ısıl işlem görmüş T7 faj örneği içerir. Çoklu PCR reaksiyonları için, faj numunesi dışındaki tüm reaktifler 1.5 mL'lik bir tüpte önceden karıştırılır. Ön karışımdaki her bir reaktifin hacmi, qPCR için faj örneklerinin sayısına bağlıdır.
- Konsantrasyonu bilinmeyen 10 biyopanlı faj numunesi ve üç nükte halinde 7 standart konsantrasyon numunesi için qPCR ön karışımını hazırlayın. Sonuç olarak, toplam 51 numune ve dolayısıyla 51 qPCR reaksiyonu vardır (yani, numune başına bir reaksiyon). 51 reaksiyon için 255 μL qPCR ana karışımı (51x 5 μL), 51 μL primer (51x 1 μL) ve 102 μL H2O(51x 2 μL) ön karışımını hazırlayın.
not: PCR karışımının 96 oyuklu qPCR plakasının her bir oyuğuna alikolanması sırasında hacim kaybını telafi etmek için birkaç ekstra PCR reaksiyonu hazırlanması önerilir.
- Toplam 51 kuyucuk (yani 51 qPCR reaksiyonu) için 96 oyuklu qPCR plakasının her bir oyuğuna 8 μL PCR premiksi ekleyin. Alikotasyon sırasında uçları değiştirmeye gerek yoktur.
- Her oyuğa 2 μL ısıl işlem görmüş T7 faj numunesi veya T7 faj referans DNA'sı ekleyin (Şekil 1B); çapraz kontaminasyonu önlemek için kuyuya farklı DNA numuneleri eklerken uçları değiştirin. Ayrıca, 2 μL DNA örneklerini qPCR ön karışımının yüzeyinin altına (yani 8 μL PCR ön karışımına) dağıtın.
- qPCR plakasını yapışkan film ile kapatın.
not: Bu adım, qPCR plakasının türünden bağımsız olarak kritik öneme sahiptir. Plakayı tamamen kapatmak için önerilen kiti kullanın; aksi takdirde, plakadaki herhangi bir sızdırmaz bölge, PCR döngüsü sırasında hacim kaybına neden olur.
- Floresan foto ağartmayı en aza indirmek için qPCR plakasını alüminyum folyo ile sarın ve qPCR ekipmanı üzerinde çalıştırmaya devam edin.
2. qPCR döngü koşulları
>NOT: qPCR döngü koşulları, belirli qPCR ekipmanında ayarlanmıştır.
- 96 oyuklu qPCR plakasını qPCR ekipmanında çalıştırın. Ekipman üzerinde, aşağıdaki deney koşullarını ayarlamak için menüden ayarları seçin (Şekil 1C).
- 10 μL'lik bir numune hacmi için döngü koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 50 ° C'de 2 dakika boyunca bir döngü, 95 ° C'de 2 dakika boyunca bir döngü, ardından 40 döngü (15 saniye boyunca 95 ° C, 1 dakika boyunca 60 ° C). Ardından erime eğrisi ayarlarını çalıştırın: 15 saniye boyunca 95°C, 1 dakika boyunca 60°C ve 15 saniye boyunca 95°C'lik bir döngü.
- Verileri analiz etmeye devam edin.
