$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ssDNA'yı Amplifiye Etmek için Asimetrik PCR
- Analiz edilecek ssDNA'yı amplifiye etmek için asimetrik bir PCR reaktif karışımı hazırlayın. Tablo 1'deki reaktifleri buz üzerinde çözdürün. Taq polimeraz enzimini (50 U/μL) buz üzerinde tutmayın, bunun yerine ihtiyaç duyulana kadar 20 °C'de saklayın.
- Tüm reaktifleri nazikçe girdaplayın ve ardından tüpleri 10 saniye boyunca 10.000 x g'da kısaca santrifüjleyin.
- Tüm reaktifleri Tablo 1'de açıklandığı gibi birleştirin.
- Numuneleri bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki koşullar altında asimetrik PCR'yi başlatın: 25 döngü (30 saniye boyunca 95 °C, 30 saniye boyunca 52 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C), 5 dakika boyunca 85 °C, 4 °C'de tutun.
2. ssDNA'yı Amplifiye Etmek için Mikroküre-PCR
NOT: Bu bölüm, bir PCR reaksiyon tüpünde ssDNA'yı amplifiye etme protokolünü açıklar. Mikroküre-PCR reaksiyonları 50 μL reaksiyon hacminde gerçekleştirildi. ssDNA'yı amplifiye etmek için kullanılan ayrıntılı diziler Tablo 2'de listelenmiştir. Bu durumda, mikrokürelerin yüzeyindeki Ap, tamamlayıcı bir şekilde rastgele DNA şablonlarına tavlanabilir. Bu, tamamlayıcı DNA zincirlerinin üretilmesi için çok önemli bir adımdır (antisens DNA zinciri, Şekil 1). Genişletilmiş DNA, mikroküre-PCR amplifikasyonu için bir şablon olarak kullanılır.
- Mikroküre-PCR reaktif karışımını hazırlayın. Tablo 3'teki reaktifleri buz üzerinde çözdürün; ancak Taq polimeraz enzimini buz üzerinde tutmayın. İhtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.
- Tüm reaktifleri nazikçe girdaplayın ve ardından tüpleri 10 saniye boyunca 10.000 x g'da kısaca santrifüjleyin.
- Mikroskobik sayım yoluyla yaklaşık ~ 25 mikro küre elde edin.
not: Bir reaksiyon tüpündeki mikro kürelerin sayısı, 40X büyütmeli bir ışık mikroskobu kullanılarak hesaplanır. Mikroküre-PCR amplifikasyonu için yaklaşık ~ 25 mikro küre kullanılır. Daha ayrıntılı bilgi Adım 3'tedir.
- Tüm reaktifleri Tablo 3'te açıklandığı gibi birleştirin.
- Numuneleri bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve aşağıdaki koşullar altında asimetrik PCR'yi başlatın: 25 döngü (30 saniye boyunca 95 °C, 30 saniye boyunca 52 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C), 5 dakika boyunca 85 °C, 4 °C'de tutun.
- Amplifikasyonu takiben, 8 μL 6x yükleme tamponu ekleyin ve her numuneden 15 μL'yi %2 agaroz jele yükleyin. Ardından, 1x TAE (Tris-asetat-EDTA, 40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA, pH 8.2) tamponunda 35 dakika boyunca 100 V'ta elektroforez gerçekleştirin.
Tablo 1. Asimetrik PCR reaktifi, bileşenleri 20 μL reaksiyonda karıştırır.
| reaktif | 1x reaksiyon için hacim (μL) | Son konsantrasyon |
| Rastgele DNA şablonu | 1 | 1 ng/μL |
| Etiketleme astarı | 1 | 0,4 μM |
| Ters astar | 1 | 0,02 μM |
| 10X Taq tamponu | 5 | 1 katı |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 milyon |
| Eski taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Su | 37,8 | - |
| toplam | 50 | - |
Tablo 2. Mikroküre-PCR için dizi bilgisi.
| şablon | sıra | Uzunluk (nt) |
| Rastgele DNA şablonu | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (Rastgele dizi, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Tag-Forward astar (Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG YASASI CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Ters astar | 5'- AĞA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Tablo 3. Mikroküre-PCR reaktifi, 50 μL reaksiyonunda bileşenleri karıştırır
| reaktif | 1x reaksiyon için hacim (μL) | Son konsantrasyon |
| Ap-Mikro Küreler | ~25 mikro küre | - |
| Rastgele DNA şablonu | 1 | 1 ng/μL |
| Tag-Forward astarı | 1 | 0,4 μM |
| 10X Taq tamponu | 5 | 1 katı |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 milyon |
| Eski taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Su | 37,8 | - |
| toplam | 50 | - |
