$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Viral RNA'nın Ters Transkripsiyonu
- Tablo 1'de listelenen RT reaktiflerini dondurucudan çıkarın, buz üzerinde tutun ve kullanmadan önce çözdürün ve girdaplayın.
- Tablo 1'de listelenen reaktiflerle 0.2 mL'lik bir PCR tüpünde 12 μL RT reaksiyon karışımı hazırlayın. Gerekenden en az bir reaksiyon boyutu daha büyük bir ana karışım hacmi hazırlayarak pipetleme varyasyonlarına izin verin.
- Bir şablon odasındaki bir PCR iş istasyonundaki RT reaksiyon karışımına 8 μL numune, pozitif kontrol RNA'sı veya negatif kontrol ekleyin. RT pozitif kontrol, sabit RABV suşu CVS-11 (meydan okuma virüsü standardı-11) ile enfekte olmuş hücre kültüründen ekstrakte edilen ve -80 ° C'de saklanan RNA'dır. Negatif kontrol, RNaz içermeyen ddH2O içerir.
- RT tüplerinin içeriğini verteksleme ile karıştırın; sonra, kısa bir süre santrifüjleyin.
- Reaksiyon tüplerini bir termal döngüleyiciye yükleyin. cDNA sentez programını aşağıdaki koşullarla ayarlayın: 42 ° C 90 dakika, 95 ° C 5 dakika ve 4 ° C beklemede. Reaksiyon hacmini 20 μL'ye ayarlayın. RT çalıştırmasını başlatın.
2. İlk tur PCR
- Tablo 2'de listelenen PCR reaktiflerini kullanana kadar temiz bir odada buz üzerinde saklayın; Ardından, çözün ve girdaplayın.
- İlk tur PCR karışımını Tablo 0.2'de listelenen reaktiflerle 2 mL'lik bir PCR tüpünde hazırlayın.
- Bir şablon odasındaki bir PCR iş istasyonundaki ilk tur PCR karışımına 2 μL'lik bir cDNA veya plazmit örneği ekleyin. PCR pozitif kontrolü, yukarıdaki RT yöntemi için adım 1.3'te belirtildiği gibi hazırlanan CVS-11 cDNA'dır. PCR negatif kontrolü dd H2O'dur.
- Mühürlü tüpleri bir PCR termal döngüleyiciye aktarın ve Tablo 3'te listelenen parametreleri kullanarak döngü yapın.
3. İkinci tur PCR
- Tablo 4'te listelenen reaktifleri kullanarak ikinci tur PCR karışımını 0,2 mL'lik bir PCR tüpünde hazırlayın.
- İkinci tur PCR karışımına 2 μL birinci tur PCR ürünü ekleyin. Ek olarak, ikinci tur PCR'nin negatif kontrolü olarak dd H2O'yu dahil edin.
- Adım 2.4'te verilenle aynı parametreleri kullanarak PCR termal döngüsü gerçekleştirin.
Tablo 1: cDNA sentezi için ters transkripsiyon reaktifleri.
| parça | Reaksiyon başına hacim (μl) |
| dNTP'ler (2,5 mM) | 4 |
| Rastgele Astar (50 μM) | 1.5 |
| Oligo(dT) 15 (50 μM) | 0,5 |
| M-MLV tamponu (5x) | 4 |
| M-MLV ters transkriptaz (200 IU/μL) | 1 |
| RNasin (40 IU / μL) | 1 |
| Toplam hacim | 12 |
Tablo 2: İlk tur PCR reaktifleri.
| parça | Reaksiyon başına hacim (μl) |
| dNTP'ler (10 mM) | 1 |
| Eski Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Taq Tamponu (10x) | 5 |
| N127 (20 μM) | 1 |
| N829 (20 μM) | 1 |
| dd H2O | 39,7 |
| Toplam hacim | 48 |
Tablo 3: Birinci ve ikinci tur PCR'nin döngü parametreleri
| sıcaklık | Saat | devir |
| 94 °C | 2 dk | 1 |
| 94 °C | 30 Saniye | 35 |
| 56 °C | 30 Saniye | 35 |
| 72 °C | 40 Saniye | 35 |
| 72 °C | 10 dk | 1 |
| 4 °C | ∞ | |
Tablo 4: İkinci tur PCR reaktifleri.
| parça | Reaksiyon başına hacim (μl) |
| dNTP'ler (10 mM) | 1 |
| Eski Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Taq Tamponu (10x) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| dd H2O | 39,7 |
| Toplam hacim | 48 |