Belirli bir viral genomik diziyi tespit etmek için iç içe PCR

Özet

Kaynak: Feng, Y., et al. Lyssavirüslerin Tespiti için Evrensel İç İçe Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, iki primer seti kullanılarak iki ardışık PCR amplifikasyon işleminden oluşan bir teknik olan iç içe polimeraz zincir reaksiyonu açıklanmaktadır. İlk primer setinin, ikinci setin yukarısındaki dizilere tavlanması amaçlanmıştır, bu da spesifik gen dizilerinin seçici amplifikasyonu ile sonuçlanır. Bu PCR, normal bir PCR'den daha hassas ve spesifiktir ve çeşitli hastalıklar için bir tespit tekniği olarak yaygın olarak kullanılmaktadır.

Protokol

1. Viral RNA'nın Ters Transkripsiyonu

1. Tablo 1'de listelenen RT reaktiflerini dondurucudan çıkarın, buz üzerinde tutun ve kullanmadan önce çözdürün ve girdaplayın.
2. Tablo 1'de listelenen reaktiflerle 0.2 mL'lik bir PCR tüpünde 12 μL RT reaksiyon karışımı hazırlayın. Gerekenden en az bir reaksiyon boyutu daha büyük bir ana karışım hacmi hazırlayarak pipetleme varyasyonlarına izin verin.
3. Bir şablon odasındaki bir PCR iş istasyonundaki RT reaksiyon karışımına 8 μL numune, pozitif kontrol RNA'sı veya negatif kontrol ekleyin. RT pozitif kontrol, sabit RABV suşu CVS-11 (meydan okuma virüsü standardı-11) ile enf....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ddH2O	çeşitli	çeşitli
dNTP'ler (10 mM)	Takara	4019
dNTP'ler (2,5 mM)	Takara	4030
Eski Taq (5 U/μL)	Takara	RR001
Mikrosantrifüj tüpleri	çeşitli	çeşitli
M-MLV ters transkriptaz (200 IU/μL)	Takara	2641bir
Oligo (dT)15	Takara	3805
PCR Makinesi	BIYO-RAD	T100
PCR Tüpleri	çeşitli	çeşitli
Pipetleyiciler	çeşitli	çeşitli
Rastgele Astar	Takara	3801
RNaz İnhibitörü (40 IU / μL)	Takara	2313bir
RNaz içermeyen ddH2O	Takara	9102
Taq Tamponu (10x)	Takara	9152A
Ipuç -ları	çeşitli	çeşitli
Vorteks karıştırıcı	çeşitli	çeşitli

Serisi adet Serisi Adet numaralı telefondan ulaşabilirsiniz. Serisi