Yöntem makalesi

Mutant DNA Dizilerindeki Dizi Varyasyonlarını Belirlemek için Yüksek Çözünürlüklü Eritme PCR

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Kisserli, A., et al. Kompleman Reseptörü 1 Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi için Yüksek Çözünürlüklü Eriyen PCR: Alzheimer Hastalığı Gen Duyarlılık Değerlendirmesi için Yenilikçi Bir Araç. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu videoda, erime sıcaklığı analizine dayalı olarak farklı dizi uzunluklarına sahip DNA fragmanlarının uzunluk polimorfizmini belirlemek için yüksek çözünürlüklü bir erime PCR tekniğini açıklıyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HRM-PCR Protokolü

  1. DNA örneklerini çözün. DNA örneklerini 1.5 mL'lik tüplerde suyla seyreltin ve bunları 10 ng/μL
    konsantrasyona ayarlayın not: Seyreltilmiş DNA'nın toplam hacmi 2 μL ile 10 μL arasında olmalıdır.
  2. Astar çözeltilerini çözün. Astar çözeltilerini 1.5 mL'lik tüplerde suyla seyreltin ve aynı 6 μM.
    konsantrasyonuna ayarlayın not: Primer dizileri ve reaksiyon koşulları Tablo 1'de verilmiştir.
  3. HRM-PCR kit solüsyonlarını çözün ve tüm içeriğin geri kazanılmasını sağlamak için girdap yaparak dikkatlice karıştırın. DNA bağlayıcı boya, MgCl2 ve su ile enzimatik karışımı içeren üç şişeyi açmadan önce bir mikrosantrifüjde kısaca döndürün. Onları oda sıcaklığında saklayın.
  4. Oda sıcaklığında 1.5 mL'lik bir tüpte, aşağıdaki bileşenleri aşağıda listelenen sırayla ekleyerek PCR karışımını 20 μL'lik bir reaksiyon için hazırlayın:
    1. DNA bağlayıcı boya ile 10 μL enzimatik karışım;
    2. 2 μL 25 mM MgCl2;
    3. 1 μL primer 1, 6 μM (son konsantrasyon: 300 nM);
    4. 1 μL primer 2, 6 μM (son konsantrasyon: 300 nM); ve
    5. 5 μL su.
      not: PCR karışımını birden fazla reaksiyona hazırlamak için, yukarıdaki hacimleri çalıştırılacak reaksiyon sayısı ve bir ek reaksiyon ile çarpın.
  5. Girdap yaparak dikkatlice karıştırın.
  6. Yukarıda hazırlanan 19 μL PCR karışımını beyaz çok kuyulu bir plakanın her bir oyuğuna pipetleyin.
  7. 1 μL konsantrasyona göre ayarlanmış DNA şablonu ekleyin.
    not: Kontrol reaksiyonları için, numunelerle her zaman negatif bir kontrol çalıştırın. Negatif bir kontrol hazırlamak için, şablon DNA'yı suyla değiştirin.
  8. Beyaz çok kuyulu plakayı sızdırmazlık folyosu ile kapatın.
  9. Beyaz çok kuyulu plakayı santrifüje yerleştirin ve uygun bir karşı ağırlıkla (yani başka bir çok kuyulu plaka) dengeleyin. Uygun adaptörlere sahip çok kuyulu plakalar için bir rotor içeren standart bir döner kovalı santrifüjde 1.500 x g'da 1 dakika
    10. santrifüjleyin.
  10. Beyaz çok kuyulu plakayı HRM-PCR cihazına yükleyin.
  11. HRM-PCR programını aşağıdaki PCR koşullarıyla başlatın:
    Denatürasyon: 10 dakika boyunca 95 °C; 1 döngü.
    Amplifikasyon: 10 saniye boyunca 95 °C, 15 saniye boyunca 62 °C ve 20 saniye boyunca 72 °C; 47 döngü.
    Erime eğrisi: 95 °C; rampa hızı: 0,02 °C/s; °C başına 25 satın alma; 1 döngü.
    Soğutma: 30 sn boyunca 40 °C; rampa hızı 2,2 °C/s; 1 döngü.

figure-protocol-1

Tablo 1: Yüksek çözünürlüklü erime analizinde kullanılan primerler ve parametreler.

>2. CR1 Uzunluk Polimorfizmini Belirlemek için HRM Analizi

>NOT: Açıklanan metodoloji (Şekil 1) yazılımımıza özgüdür (Bkz. Malzeme Tablosu), ancak diğer yazılım paketleri de kullanılabilir.

  1. CR1 uzunluk polimorfizmi tarama analizini gerçekleştirmek için bir gen tarama yazılımı açın.
  2. Amplifikasyon programını ve erime eğrisi programını içeren deneyi açın.
  3. Modül çubuğunda Örnek düzenleyici'yi tıklatın ve ardından Tarama iş akışını seçin.
  4. Örneklerin özelliklerini tanımlayın (örneğin, isim; bilinmeyen veya negatif kontrol).
  5. Modül çubuğunda Analiz'e tıklayın.
  6. Yeni Analiz Oluştur listesinde, Gen Taraması'nı seçin.
  7. Erime eğrilerini normalleştirmek için Normalleştirme sekmesine tıklayın.
  8. Erime eğrilerinin sıcaklık eksenini (x ekseni) sıfırlamak için Sıcaklık kaydırma sekmesine tıklayın.
    not: Alttaki grafik, hem normalleştirilmiş hem de sıcaklık kaydırmalı erime eğrilerini göstermektedir.
  9. Sonuçları analiz etmek ve gruplandırmayı belirlemek için Hesapla düğmesine tıklayın.
  10. Normalleştirilmiş ve Kaydırılmış Erime Eğrileri ile Normalleştirilmiş ve Sıcaklık Kaydırılmış Fark Grafiği'ni görüntülemek için grafikler alanındaki Fark grafiği sekmesine tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1: Protokolün 2. adımında kullanılan yazılımın grafik arayüzünün ekran görüntüleri. (A) Gen tarama yazılımını açın. (B) Amplifikasyon programı ve erime eğrisi programı. (C) Modül çubuğundaki Örnek düzenleyici'ye tıklayın. (D) Tarama'yı seçin. (E) Numunelerin özelliklerini tanımlayın. (F) <...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Laboratuvar önlüğükoruma
SensiCareIce pudrasız Nitril Muayene eldivenleriMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, Amerika Birleşik Devletleri486802Numune koruması
Eppendorf Reference 2 pipet, 0,5-10μLEppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa4920000024Numune pipetleme
Eppendorf Reference 2 pipet, 20-100μLEppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa4920000059Numune pipetleme
Eppendorf Reference 2 pipet, 100-1000μLEppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa4920000083Numune pipetleme
TipOne 10μL Dereceli, filtre ucuStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, AlmanyaS1121-3810Numune pipetleme
TipOne 1-100μL eğimli, filtre ucu Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, AlmanyaS1120-1840 SerisiNumune pipetleme
ART 1000E Bariyer UcuThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Fransa2079ENumune pipetleme
Eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler, 1.5 mL, Eppendorf KalitesiEppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa30120086karışım
Girdap-Cin 2Scientific Industries, Inc, Bohemya, NY 111716, ABDSI-0236karışım
Mikro 200 santrifüjHettich Zentrifugen, D-78532, Almanya0002020-02-00Santrifüj
Multipette E3Eppendorf Fransa SAS, F-78360 Montesson, Fransa4987000010dağıtım
Light Cycler 480 çok kuyulu plaka 96, beyazRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Almanya4729692001Reaksiyon yeri
Light Cycler 480 sızdırmazlık folyosuRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Almanya4429757001kapsama alanı
LightCycler 480 Enstrüman II, 96 kuyuluRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Almanya05015278001Yüksek Çözünürlüklü Erime Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Heraeus Megafuge 11R santrifüjThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Fransa75004412Santrifüj
LightCycler 480 Yüksek Çözünürlüklü Eritme UstasıRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Almanya04909631001Reaksiyon reaktifleri
CN3 astar: 5'ggccttagacttctcctgc 3'Eurogentec Biyoloji Bölümü, B4102 Seraing, BelçikaReaksiyon reaktifi
CN3re astar: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'Eurogentec Biyoloji Bölümü, B4102 Seraing, BelçikaReaksiyon reaktifleri
light cycler 480 SW 1.5.1 yazılımıRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, AlmanyaHRM-PCR CR1 polimorfizm veri analizi için kullanılan yazılım
Serisi Serisi

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DNA PolimorfizmiErime E risi AnaliziPCR ProtokolDNA Fragman AnaliziFloresan Raporlay c BoyaCR1 GenotiplemesiMolek ler Biyoloji

İlgili makaleler