Lökositlerde DNA Metilasyonunu Tespit Etmek için Multipleks Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Özet

Kaynak: Malic, L., et al. Hematolojik Teşhis için Polimer Damlacık Jeneratör Cihazı kullanılarak Metilasyona Özgü Multipleks Damlacık PCR.J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, klinik tanı ve prognoz için erken bir biyobelirteç olarak farklı beyaz kan hücresi popülasyonlarında metillenmiş DNA bölgelerinin eş zamanlı olarak ölçülmesi için multipleks damlacık polimeraz zincir reaksiyonu tekniğini göstermektedir.

Protokol

1. Damlacık üretimi ve PCR

>NOT: Tablo 1, demetillenmiş gen hedeflerinin multipleks amplifikasyonu için gerekli olan C-LESS, CD3Z ve Foxp3 genleri için çift söndürülmüş hidroliz probları ile birlikte ileri ve geri primerler hakkındaki bilgileri özetlemektedir.

1. Ana karışımı Tablo 2'de anlatıldığı gibi hazırlayın.
2. Enzim karışımı hariç ana karışımın tüm bileşenlerini çözün. Ana karışımı yukarı-aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve kısa bir süre aşağı döndürün.
3. Uygun hacimde (1 μL) bisülfite dönüştürülmüş DNA'yı bir PCR tüpündeki ana karışıma ekleyin. Reaksiyonu yukarı-aşağı pipetleyerek karıştırın ve kısa bir süre aşağı döndürün.
4. Tek kullanımlık akışkan borularını (ID 0.25 mm, OD 1.6 mm) PEEK bağlantı parçalarını kullanarak iki hassas cam şırıngaya (250 μL hacim) bağlayın.
5. Bir hassas cam şırıngayı %5 floro-yüzey aktif madde içeren 250 μL taşıyıcı yağ ile önceden doldurun.
6. Emülsifikasyon sırasında tüm numune hacminin dağıtılmasını sağlamak için 100 μL PCR karışımını yüklemeden önce başka bir hassas cam şırıngayı 50 μL taşıyıcı yağ ile önceden doldurun.
7. Damlacık oluşumunu gerçek zamanlı olarak gözlemlemek ve kaydetmek için yüksek hızlı bir kamera ile donatılmış dik ışık mikroskobunun bir aşamasına bir damlacık mikroakışkan cihazı kurun.
8. Önceden doldurulmuş şırıngaları programlanabilir şırınga pompasına yerleştirin ve bağlantı parçalarıyla PEEK rakorunu kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), şırıngaların borusunu damlacık mikroakışkan cihazının ilgili giriş kanallarının borusuna bağlayın.
9. Boruyu damlacık üretecinin çıkışından 0.5 mL'lik bir PCR tüpünün içine yerleştirin.
10. Şırınga pompasının akış hızını 2 μL/dk'ya ayarlayın ve elde edilen emülsiyonu toplamadan önce damlacık boyutunun stabilize olmasına izin verin.
11. Emülsiyonu toplayın ve termal döngü için 75 μL'yi 0.2 mL'lik bir PCR tüpüne aktarın.
12. Termal döngü sırasında damlacıkların birleşmesini önlemek için PCR tüpündeki yağ içeriğinin dağılmış fazın hacmiyle yakından eşleştiğinden emin olun.
13. 0.2 mL PCR tüpünü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve döngü protokolünü aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 95 °C'de 5 dakika ön ısıtma, ardından 15 saniye boyunca 95 °C'de 45 döngü denatürasyon ve 60 °C'de 30 saniye tavlama/uzatma.

Tablo 1: Primer ve hidroliz probu tasarımı.

FOXP3 İleri	GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG
FOXP3 Ters	TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA
CD3Z İleri	GGA, TGG, TTG, TGG, TGA, AAA, GTG
CD3Z Ters	CAA, AAA, CTC, CTT, TTC, TCC, TAA, CCA
C-LESS İleri	TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA
C-LESS Ters	TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C
FOXP3 Probu	/56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/
CDZ3 Probu	/56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/
C-Less Prob	/56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

Tablo 2: mdPCR için ana karışım tarifi.

reaktif	Stok Çözümü	Ana Karışım Hacmi	Çalışma Konsantrasyonu
Tris-HCl	1 AYLIK	2 μL	20 milyon
Kartal	1 AYLIK	10 μL	100 milyon
MgCl2	25 milyon	16 μL	4 milyon
C-LESS Astarlar	10 μM	10 μL	Her biri 1 μM
CD3Z Astarlar	10 μM	10 μL	Her biri 1 μM
FOXP3 Primerler	10 μM	10 μL	Her biri 1 μM
C-LESS probu	10 μM	5 μL	500 deniz mili
CD3Z probu	10 μM	5 μL	500 deniz mili
FOXP3 probu	10 μM	5 μL	500 deniz mili
HotStarTaq DNA Polimeraz	5 Birim/μL	8 μL	0,4 Birim/μL
Bisülfit ile muamele edilmiş DNA Hedefi	değişken	değişken	değişken
Nükleaz İçermeyen Su		değişken
Toplam Hacim		100 μL

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
PCR tüpü	Bio-Rad, Mississauga, AÇIK	TFI0201
Floro-yüzey aktif madde	RAN Biyoteknoloji, Beverly, MA	008-FloroYüzey Aktif Madde
Tek kullanımlık akışkan boru	Dolomit	3200063
Tek kullanımlık akışkan boru	Dolomit	3200302
PEEK bağlantı parçaları	IDEX Sağlık ve Bilim, Oak Harbor, WA	P-881
Taşıyıcı Yağ	3M, Aziz Paul, MN
Dik ışık mikroskobu	Nikon, Melville, NY

Serisi