$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Genomik DNA'nın Kalite Kontrolü
NOT: Genomik DNA (gDNA), iyi bilinen silika membran bazlı DNA saflaştırma yöntemi kullanılarak periferik kandan ekstrakte edildi. Aşağıdaki prosedürlerden önce, gDNA konsantrasyonu bir spektrofotometre kullanılarak belirlendi.
- gDNA örneğini 10-100 ng/μL'lik bir konsantrasyonda hazırlayın.
- 8 tüplük bir şeride 10 μL DNA örnek tamponu ekleyin.
- Tüplere 1 μL DNA merdiveni veya gDNA ekleyin. Mikroplaka ekini kullanarak karışımı 1 dakika boyunca vorteksleyin.
- Tüpü, jel cihazını ve pipet uçlarını elektroforez cihazına (Malzeme Tablosu) yükleyin ve 'Başlat' düğmesine basarak çalıştırmayı başlatın.
not: Elektroforez sistemi, Başlat düğmesine tek bir tıklama ile otomatik olarak çalışacaktır.
- DNA örneği tamponunda bulunan alt işaretleyicinin elektroferogramlara doğru şekilde atandığını onaylayın. Yanlış atanmışsa, işaretçiyi yazılımın 'Elektroherogram modunda' manuel olarak atayın.
not: DNA bütünlük numarası (DIN) otomatik olarak hesaplanacaktır. DIN değeri DNA bütünlüğünden gelir. Yüksek ve düşük DIN değerleri, sırasıyla yüksek derecede sağlam ve güçlü bir şekilde bozulmuş gDNA'yı gösterir.
- gDNA konsantrasyonunu (> 200 bp) otomatik olarak hesaplamak için yazılımın 'Bölge modunda' gDNA'nın boyut bölgesini (> 200 bp) belirtin.
2. Primer ve Prob Tasarımı
- Aşağıdaki koşullar altında herhangi bir açık erişimli araç kullanarak erime sıcaklığı (Tm) değerlerini hesaplayın: 10-25 baz, 50 mM Na+/K+, 0,80 mM dNTP ve 3 mM Mg2+ (Malzeme Tablosu). Tm değeri yaklaşık 60 °C ve amplikon uzunluğu 100-300 bp olan hedef alelleri içeren genomik bölgeyi amplifiye etmek için ileri ve geri primerleri tasarlayın.
NOT: Oligonükleotidlerin konsantrasyonu için Tablo 1'e bakın.
- Aşağıdaki koşullara dayalı olarak referans ve varyant aleller için kilitli nükleik asit (LNA) problarını tasarlayın: (i) Her probda 1-6 LNA bulunur; (ii) her probun sırasıyla 5'- ve 3'-terminallerinde bir floresan boya ve bir söndürücü bulunur; (iii) eşleşen ve eşleşmeyen probların Tm değerleri arasındaki fark > 10 °C'dir; (iv) Eşleşen ve eşleşmeyen probların Tm değerleri, sırasıyla primerlerinkinden daha yüksek ve daha düşüktür [örneğin, ileri astar: 60.8 °C, ters astar: 59.8 °C, referans alel probu (eşleşmiş/eşleşmemiş): 62.6/45.3 °C, varyant alel probu (eşleşmiş/uyumsuz): 61.7/50.5 °C]. Tm değerleri, adım 2.1 için de kullanılan açık erişim aracı kullanılarak hesaplanmıştır.
- Tasarlanan primerlerin ve probların, veri tabanlarından [örneğin, Tek Nükleotid Polimorfizmi veritabanı (dbSNP)] belirlendiği üzere %> 0.1 frekansa sahip tek nükleotid polimorfizmlerini kapsamadığından emin olun.
3. Dijital PCR
- Primerleri, probları ve gDNA stok çözeltilerini Tablo 1'de açıklanan konsantrasyonlarda bir TE tamponu ile hazırlayın ve -20–4 °C'de saklayın.
- Reaktifleri oda sıcaklığında toplam 15 μL hacimde Tablo 1'de tarif edildiği gibi nihai bir konsantrasyona kadar karıştırın.
- Şablonsuz kontrolde (NTC) gDNA yerine 3 μL damıtılmış su ekleyin.
- Pipetleme hatasını hesaba katmak için PCR karışımının 3,5 katını üç nüsha halinde hazırlayın.
- Karıştırmak için PCR karışımını yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Yükleme platformunu 8 tüplü şeritte yerleşik talaşların üzerine yerleştirin ve bunları otomatik yükleyiciye yerleştirin. Çip ile yükleme platformu arasında temas olduğundan emin olun.
- Platforma bir yükleme sürgüsü takın ve durdurucu yükleyiciden uzaktayken kaydırıcıyı tutun.
- Kaydırıcının ucuna yakın bir yerde platforma 15 μL PCR karışımı pipetleyin (Şekil 1A).
- Yükleyicinin düğmesine basarak yükleyiciyi çalıştırın (yaklaşık 1 dakika).
not: Platformda az miktarda PCR karışımının kalması sorun değildir. Yükleyiciyi sırayla yeniden çalıştırmak mümkündür.
- PCR karışımıyla doldurulmuş tüp içinde çipi, sızdırmazlık arttırıcının yan yuvasına yerleştirin. Talaşı kırmamak için sürgülü kapağı ve üst kapağın kenarını itin (Şekil 1B).
- Sızdırmazlık arttırıcıyı çalıştırın (yaklaşık 2 dk). Eksik bir sızdırmazlık pozitif sinyallerin çapraz kontaminasyonuna neden olduğundan, bir sıvı birikintisi hala görünüyorsa, sızdırmazlık arttırıcıyı 1 dakika boyunca sırayla yeniden çalıştırın (Şekil 1C ve 1D).
- Tüplere yağ bazlı bir reaktif olan 230 μL sızdırmazlık sıvısı ekleyin.
not: Talaşlar şimdi sıvıya daldırılmalıdır.
- Tüpleri termal döngüleyiciye yerleştirin. Termal döngüleyiciyi Tablo 2'de açıklandığı gibi çalıştırın (yaklaşık 2 saat). Pozitif bölümlerin eşit olmayan bir dağılımı varsa PCR'nin sıcaklığını veya süresini ayarlayın (Şekil 1E).
NOT: rampa hızının yaklaşık 1 °C/s'ye ayarlanması önerilir.
- Temel gürültüyü azaltmak için tüpleri en az 15 dakika termal döngüleyicide bırakın.
not: Tüpler gece boyunca da bırakılabilir. Ertesi gün bile floresan sinyalleri tespit edildi.
- Tüpleri algılama aparatına yerleştirin ve jig içine 6 mL damıtılmış su dökün. Tüplerin içinde ve dışında hava kabarcıkları görünüyorsa, bunları temizleyin (Şekil 1F ve 1G).
- Jig'i dedektöre yükleyin ve Floresan, Deney ve Örnek/NTC sekmelerini seçtikten sonra yazılımın 'Çalıştır' düğmesine tıklayarak çalıştırın (Malzeme Tablosu).
NOT: Varsayılan yoğunluğa sahip sekiz numunenin çift renk algılaması yaklaşık 4 - 5 dakika sürer.
- Konum grafiğini, histogramı ve 2B dağılım grafiğini onaylayın.
NOT: Negatif bölümlerin floresan yoğunluğu yüksekse, yazılımın Ayarlar düğmesine tıklayarak yoğunluğu 30-70 aralığına düşecek şekilde ayarlayın.
- Aşağıdaki formülü kullanarak varyant alel fraksiyonunu (VAF) hesaplayın:
Burada, Cv ve Cr sırasıyla varyantın ve referans alelinin kopya numaralarıdır.
not: Poisson istatistiklerine dayalı olarak yazılım programında otomatik olarak hesaplanırlar.
4. PCR Ürününün Toplanması
- Sızdırmazlık sıvısını tüpten çıkarın.
- Tüpe 100 μL TE tamponu ekleyin. 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve tüpü kısaca santrifüjleyin.
- TE çözeltisini başka bir tüpe aktarın ve 30 μL 3 M sodyum asetat ve 200 μL etanol ekleyin.
- Çözeltiyi gece boyunca -20 °C'de soğutun.
- Çözeltiyi 16.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- Tüpe 300 μL% 80 etanol ekleyin ve girdap yapın.
- Çözeltiyi 16.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Çökeltinin 5 dakika kurumasına izin verin.
- Havada kuruduktan sonra çökeltiyi 1-5 μL TE tamponunda çözün.
- Gerekirse, adım 1'e atıfta bulunarak bir elektroforez cihazı kullanarak ürün boyutunu değerlendirin. Yüksek hassasiyet için jel cihazına 1 μL solüsyon yükleyin (Malzeme Tablosu).
