$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
NOT: Bu prosedür, insanların taze donmuş dokularında az sayıda cDNA molekülünün tespiti için özel olarak tasarlanmıştır. Doku kesitleri, daha önce doğrulanmış hasta kaynaklı mide tümörü veya normal doku örneklerinden hala donmuş halde kuru buz üzerinde kesilmiştir.
1. RNA İzolasyonu ve Saflaştırılması
- RNA ekstraksiyonu
not: RNA izolasyonu, belirli bir ürün kullanılarak kaputun altında gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu). Bununla birlikte, ticari olarak çeşitli izolasyon kitleri mevcuttur.
- 50 - 100 mg ince kesilmiş taze donmuş doku örneğini 1.5 mL'lik bir tüpte 1 mL RNA izolasyon reaktifi ile homojenize edin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin. Tüpleri gece boyunca -80 ° C'de inkübe edin.
- Numuneyi içeren tüpü oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve 15 saniye boyunca girdaplayarak karıştırın.
- Tüpü buz üzerinde tutun, 200 μL kloroform ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın.
- Tüpleri oda sıcaklığında 60 saniye inkübe edin ve 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
- Sulu fazı 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 20 μg glikojen ekleyin.
not: Kontaminasyonu azaltmak için interfaz veya organik katmanlardan herhangi birinin aktarılmasından dikkatli bir şekilde kaçınmak önemlidir.
- 500 μL izopropanol ekleyin, karıştırmak için tüpü ters çevirin ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- RNA.
çökeltmek için tüpü 12.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin
not: RNA, tüpün yanında ve altında, genellikle santrifüjlemeden sonra görünmez olan jel benzeri bir topakta bulunacaktır.
- Çökeltiyi bozmadan süpernatanı çıkarın ve pipetleyerek 1 mL %75 etanol ile yıkayın.
- Tüpü 7.500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve peleti bozmadan süpernatanı çıkarın.
- Peletin çökelti şeffaf hale gelene kadar kurumasını bekleyin ve 50 μL RNaz içermeyen suda çözün.
- Numuneleri, miktar tayininden önce en az gece boyunca -80 °C'de dondurun.
- Genomik DNA eliminasyonu ve RNA saflaştırması
not: Kirletici DNA'yı sindirmek için düşük bolluktaki hedeflerin analizleri için bir DNaz sindirim aşaması ve ardından sütun bazlı bir RNA saflaştırması önerilir.
- Liyofilize DNaz I'i (1.500 Kunitz birimi) bir şırınga kullanarak 550 μL RNaz içermeyen suda çözün, şişeyi ters çevirerek hafifçe karıştırın ve sulandırılmış stok çözeltisini alikotlara bölün.
- 1.5 mL'lik bir tüpte, kitten 15 μg RNA, 10 μL DNaz Sindirim tamponu (Malzeme Tablosunda listelenmiştir), 2.5 μL DNaz I stok çözeltisi ve RNaz içermeyen su ile numunenin hesaplanan hacmini 100 μL'ye aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- 350 μL doku lizis tamponu ekleyin (kitten, Malzeme Tablosuna bakın) ve pipetleme ile karıştırın.
- 250 μL %100 etanol ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.
- Tüm hacmi (700 μL) yeni bir döndürme kolonuna aktarın ve 15 saniye boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
- Filtreyi yeni bir toplama tüpüne aktarın, kolona 500 μL %80 etanol ekleyin ve 2 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
- Döndürme kolonunun kapağını açın ve filtreyi kurutmak için yeni bir toplama tüpü ile 5 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüjleyin; ardından filtreyi 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Doğrudan filtre kolonuna 14 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve 1 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
- Numuneleri buz üzerinde tutun ve tezgah üstü bir spektrofotometrede 2 μL numune kullanarak miktar tayinine devam edin veya RNA'yı kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
2. Dijital PCR Reaksiyon Kurulumu
- dPCR reaksiyon karışımı ve numune hazırlama
- Ana karışımı ve tahlili oda sıcaklığında en az 20 dakika çözdürün.
- cDNA örneklerini 6 μL su içinde 300 ng'lik bir konsantrasyona seyreltin.
- Ana karışımı nazikçe girdaplayın ve karışımı, 11,4 μL.
'lik bir nihai hacim için 8,7 μL ana karışım, 0,87 μL CDH1a özel tasarlanmış tahlil astarı ve 1,83 μL nükleaz içermeyen su içeren steril bir tüpte hazırlayın
not: CDH1a özel olarak tasarlanmış tahlil astarı detayları için Malzeme Tablosuna bakın.
- Hazırlanan karışımın 11.4 μL'sini seyreltilmiş cDNA örneğine aktarın, hafifçe karıştırın ve kısaca santrifüjleyin.
not: Pipetlemeden kaynaklanan hacim kaybını telafi etmek için hacimler %20 fazlalık içerir. Karışımı tüm örnekler ve şablon kontrolü (NTC) için hazırlayın.
- Çip hazırlama
Not: En iyi sonuçlar için çipleri mümkün olan en kısa sürede yükleyin.
- Talaş yükleyiciyi prize takın ve gösterge ışığı yeşile dönene kadar bekleyin.
- Bu adımı kolaylaştırmak için pistonu 1-2 mm hafifçe geri çekerek ve serbest bırakarak daldırma sıvısı şırıngasının kapağını çıkarın ve bir uçla değiştirin.
- Yeni bir çip alın ve numune ile ilişkilendirmek için kapakta yazılı olan kodu not edin.
- Kapağı dikkatlice yanından tutun, koruyucu filmi soyun ve yapışkan yüzü yukarı bakacak şekilde kapağı doğru yönde yerleştirin.
- İç kısma dokunmamaya dikkat ederek dikkatlice bir talaş alın ve cl'yi açmak için kolu aşağı bastırarak doğru konumda talaş yuvasına yükleyin.amp.
- Yükleyiciye yeni bir yükleme bıçağı yükleyin ve sıkıca yerine oturduğundan emin olmak için hafifçe itin.
- 14.5 μL dPCR reaksiyon karışımını hava kabarcıkları oluşturmadan veya bıçağı saptırmadan yükleme bıçağına aktarın, ardından hacmi çip üzerine dağıtmak için siyah yükleme düğmesine basın.
- Daldırma sıvısı şırıngasını kullanarak talaş yüzeyine yaklaşık 20 damla aktarmak için yüzeye uçla dokunmamaya dikkat edin.
not: Kenarlardan sıvı dökmeden tüm yüzeyi kaplamak önemlidir.
- Kapağın çip ile temas etmesini sağlamak için yükleyici kolunu çevirin ve 15 saniye boyunca aşağı bastırın.
- Çipi serbest bırakmak ve kolu konumuna geri döndürmek için kapak düğmesine basın.
- Monte edilmiş çipi 45°'lik bir açıyla tutun ve daldırma sıvısını şırınga ile doldurma portundan dikkatlice dağıtın, hava kabarcığı olmadığından emin olmak için çipi hafifçe döndürün ve fazla sıvıyı steril bir mendille çıkarın.
- Talaş kapağının üstündeki etiketi nazikçe soyarak talaş kutusunu kapatın ve doldurma portunun üzerine en az 5 saniye bastırın.
- Çipi termal döngüleyiciye yüklemeye hazır olana kadar karanlıkta saklayın.
not: Hazırlanan cipsler 2 saat içinde kullanılmalıdır.
- dPCR reaksiyonu
- Kapağı açın ve tek bir blok kullanıldığında bile adaptörleri her iki bloğa da takın.
- Çipleri numune bloğuna doğru pozisyonda yerleştirin.
not: Doldurma portu, herhangi bir hava kabarcığının çipin penceresini bozmadan üste çıkmasına izin vermek için yükseltilmiş bir konumda termal döngüleyicinin önüne doğru yönlendirilmelidir. İki bloğu dengelemek için boş fişler kullanın.
- Talaşları tamamen kaplamak için termal pedi numune bloğunun üzerine yerleştirin.
- Kapağı kapatın ve aşağıdaki koşulları uygulayarak PCR çalıştırmasını başlatın: 96 °C'de 10 dakika tutun; 2 dakika boyunca 60 °C'de 45 döngü ve 30 saniye boyunca 98 °C; 60 °C'de 2 dakika tutun; 4 °C'de tutun. Termal döngüleyiciyi kapatın ve talaşları oda sıcaklığında en az 10 dakika çözdürün.
not: Çip analizi bir saat içinde yapılmalıdır.
- Çip analizi
- Cihazın kapağını açın ve termal pedleri çıkarın, ardından talaşları adaptörlerden çıkarın.
not: Cipsleri analize kadar karanlık ve temiz bir yerde saklayın.
- Talaş yüzeyini izopropanol ve steril bir mendil ile temizleyin.
not: Her çipi sızıntı veya olası sorunlar açısından inceleyin.
- Verileri kaydetmek için USB'yi dedektör sistemine takın.
- Dedektör sisteminin talaş tepsisini açın, talaşı yüzü yukarı bakacak şekilde doğru konuma yükleyin ve ardından tepsiyi kapatın.
- İşlem için 30 saniye bekleyin, ardından çipi çıkarın ve bir sonrakini takın.
- İşlenen tüm çipler için analizin tamamlanmasını bekleyin, ardından dosyaları aktarmak için USB'yi bir bilgisayara takın.
not: Analiz için toplam süre yaklaşık 2 ila 3 dakika/çiptir.
3. Veri Analizi ve Yorumlama
- Tüm aşağı akış analizlerini gerçekleştirmek için gereken bulut tabanlı yazılım platformuna bağlanın.
- Bir proje oluşturun ve ilgilenilen çiplerin tüm veri dosyalarını içe aktarın.
- Numune adını girin; "Cipsleri Tanımla" sekmesinde kullanılan boyayı ve tahlili seçin.
- Çipin kabul edilebilir olup olmadığını, "Verileri Gözden Geçir" sekmesinde görselleştirerek, numunenin çipe ne kadar kapsamlı bir şekilde yüklendiğini ve kaç veri noktasının değerlendirilebilir olduğunu kontrol ederek belirleyin.
not: 13.000'den az değerlendirilebilir veri noktasına sahip çipleri reddedin.
- Ekranın sağ tarafında seçilen çipin dağılım grafiğine geçin; tüm çiplere floresein amid (FAM) raportör boya sinyalleri (Y ekseni) için 6.000'lik bir eşik uygulayın.
not: Eşik ayarı, kullanılan tahlillere göre değişebilir.
- Yanlış pozitif sonuçları önlemek için kement aracını kullanarak dağılım grafiğindeki göreli noktayı seçerek ve "belirlenmemiş" üzerine basarak şüpheli pozitif sinyalleri kaldırın. Kalan tüm pozitif noktalar, analiz edilen nadir hedefin cDNA kopyalarının varlığını gösterir.