$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>NOT: Bu çalışmada kullanılan rekombinant proteinler, Hsp90 ve Cdc37, ticari olarak elde edilmiştir (bkz.
1. Çip Aktivasyonu
>NOT: Deneyde kullanılacak tüm malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Hazırlanan tüm çözeltileri steril bir 0,2 μm filtreden süzün.
- 15 mL'lik bir tüpte 2.5 mL 1 M 2- (N-morfolino) etan sülfonik asit (MES) tamponuna (pH = 6.0) 2 mg EDC ekleyerek 1-Etil-3- (3-dimetilamino propil) karbodiimid (EDC) çözeltisi hazırlayın. Ayrı bir 15 mL tüpte 2.5 mL 1 M MES tamponuna (pH = 6.0) 6 mg sülfo-NHS ekleyerek N-Hidroksisülfosüksinimid (sülfo-NHS) çözeltileri hazırlayın. Her çözeltiden 50 μL'yi bağımsız tüplerde ayırın ve ileride kullanmak üzere -20 ° C'de saklayın.
- Eşit hacimlerde EDC ve sülfo-NHS solüsyonunu (50 μL EDC + 50 μL sülfo-NHS) yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın (girdap yapmayın).
NOT: Uygun çip işlevselleştirmesi için etkili çapraz bağlamayı sürdürmek için EDC/sulfo-NHS'nin karışık çözeltisi 30 dakika içinde kullanılmalıdır.
- Şirket tarafından sağlanan biyosensör çipini (5,7 cm x 2,4 cm; Malzeme Tablosuna bakınız) kapağı takılı bir cam Petri kabına yerleştirin. Çip aktivasyonunda yer alan tüm işlevselleştirme adımlarının Petri kabı içinde yapılması önerilmektedir. Biyosensör çipine 50 μL 1 M MES tamponu (pH = 6.0) uygulayın, oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin ve ardından tamponu aspire edin.
- Sensör çipine hemen 50 μL EDC/sulfo-NHS solüsyonu uygulayın. Petri kabını örtün ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Çipten EDC / sulfo-NHS çözeltisini aspire edin.
- Çipi 50 μL 1 M MES tamponu (pH = 6.0) ile bir kez durulayın; MES tamponunu aspire edin.
2. Hedef protein immobilizasyonu
- Çipi 2x 50 μL 1x PBS (pH = 7.4) ile durulayın. PBS'yi çipten aspire edin ve hedef molekülü, Hsp90'ı (50 μL; 500 nM) ekleyin.
NOT: Arabellek uyumsuzluğu tüm deneyi mahvedebilir; bu nedenle, deneyden önce, hedef molekülün kalibrasyon için kullanılanla aynı tamponda olduğundan emin olmak önemlidir (örneğin, 1x PBS (pH = 7.4)). Gerekirse, deneyden önce gece boyunca diyaliz ile bir tampon değişimi gerçekleştirin. Bu deneyde, her iki rekombinant protein, Hsp90 ve Cdc37 için, 1x PBS'ye (pH = 7.4; Malzeme Tablosuna bakınız) karşı 4 ° C'de uygun tampon değişimi ile gece boyunca diyaliz yapıldı. Hedef materyalin konsantrasyonu (bu durumda Hsp90), farklı deneysel protokollere ve hedef materyallerin doğasına (protein/peptit/ligandlar) göre değişebilir.
- Cam Petri kabını kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hedef molekülü içeren çözeltiyi aspire edin ve 3x'i 50 μL 1x PBS (pH = 7.4) ile durulayın. Çipten 1x PBS (pH = 7.4) çözeltisini aspire edin.
- Çipe 50 μL Quench 1 (1x PBS (pH = 7.4)) çözeltisinde 3.9 mM amino-PEG5-alkol ekleyin. Cam Petri kabını kapatın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Quench 1 solüsyonunu çipten aspire edin.
- Çipe 50 μL Quench 2 (1 M etanolamin (pH = 8.5)) çözeltisi ekleyin. Cam Petri kabını kapatın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Quench 2 solüsyonunu çipten aspire edin ve 50 μL 1x PBS kullanarak çipi 5x durulayın, son PBS damlacığını sensörde bırakın.
3. Analit numunelerinin hazırlanması
- İstenilen konsantrasyon aralığında Cdc37 için analit seyreltme serisi hazırlayın. İlk deney için aşağıdaki konsantrasyonlar kullanıldı: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM ve 5.000 nM. İkinci deney için, 0.4 nM ila 200 nM arasında değişen farklı bir konsantrasyon seti kullanıldı.
- Güvenilir bir KD değeri elde etmek için deneyi en az sekiz farklı analit konsantrasyonu içerecek şekilde tasarlayın. Analit proteininin farklı seyreltmelerini, kalibrasyon ve hedef protein için kullanılanla aynı tamponda hazırlayın; burada 1x PBS'dir (pH = 7.4).
4. Aktive edilmiş biyosensör çipinin FEB cihazına yüklenmesi
NOT: FEB cihazı, LED ışık göstergelerine sahip bir okuyucu ve biyosensör çipini yerleştirmek için bir kartuştan oluşur.
- Hedef protein immobilizasyonundan sonra, etkinleştirilmiş çipi USB üzerinden bir bilgisayara bağlanan cihazın kartuşuna yerleştirin. Çip yerleştirildikten sonra, okuyucu üzerinde FEB cihazının deney için hazır olduğunu gösteren yeşil bir LED ışığı görüntülenecektir. Deneyi aşağıda açıklandığı gibi adım adım izlemek için şirket tarafından sağlanan otomatik yazılımı (Malzeme Tablosuna bakın) FEB cihazının bağlı olduğu bilgisayara yükleyin.
5. Denemeyi çalıştırın
- Otomatik yazılımda Deneyi Çalıştır modülüne basın ve Rejenerasyon ile 10 Nokta veya istediğiniz başka bir protokolü seçin. Aşağıdaki bilgileri doldurun: operatör adı, deney adı, tarih (örneğin, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); rejenerasyon tamponu (örneğin, PBS tamponu); hareketsiz hale getirilmiş hedef (örneğin, Hsp90); çözelti içinde analit (ör., Cdc37).
- Yazılımda görüntülenen Deneye Başla düğmesine basın ve aşağıda açıklandığı gibi otomatik yazılım tarafından gösterilen talimatları izleyin.
not: Yazılım tamamen otomatiktir, kullanıcı dostudur ve kullanıcıyı deney boyunca adım adım yönlendirir. Ekranda, deneyin her adımında daha fazla ilerlemek için talimatlar içeren bir açılır pencere görünecektir. Yazılım, deney boyunca her analit konsantrasyonu için kalibrasyon, analit ilişkilendirme, ayrışma, rejenerasyon ve yıkamadan (5x) ardışık olarak her tekrarlayan adım için talimatlar sağlayacaktır.
- Cihaz kalibrasyonu yapın. Bunu yapmak için, kalan PBS çözeltisini çipten aspire edin ve 50 μL kalibrasyon tamponu uygulayın (1x PBS; pH = 7.4). Devam düğmesine basın ve kalibrasyon adımı bitene kadar 5 dakika bekleyin. Yazılım, kalibrasyon adımı için belirlenen uç noktayı (5 dakika) ve takip etmek için bir uyarı alarmı görüntüler.
- Ardından, bir analit ilişkilendirmesi gerçekleştirin. Bunu yapmak için, kalibrasyon tamponunu çipten aspire edin ve 50 μL en düşük analit konsantrasyonunu (25 nM Cdc37) uygulayın. Devam düğmesine basın ve ilişkilendirme adımı bitene kadar 5 dakika bekleyin. Yazılım, devam etmek için bir uyarı alarmıyla birlikte ilişkilendirme adımının uç noktasını (5 dakika) görüntüler.
- Bir analit ayrışması gerçekleştirin. Bunu yapmak için, analit çözeltisini çipten aspire edin ve 50 μL ayrışma tamponu uygulayın (1x PBS; pH = 7.4). Devam düğmesine basın ve ayrışma adımı süresi (5 dk) bitene kadar 5 dakika bekleyin. Yazılım, ayrışma adımı için son noktayı (5 dakika) takip etmek için bir uyarı alarmı ile görüntüler.
- Ardından, çip rejenerasyonu gerçekleştirin. Ayrışma solüsyonunu çipten aspire edin ve 50 μL rejenerasyon tamponu uygulayın (1x PBS; pH = 7.4). Devam düğmesine basın ve rejenerasyon adımı süresi (30 sn) bitene kadar 30 saniye bekleyin. Yazılım, rejenerasyon adımı (30 sn) için son noktayı ve takip etmek için bir uyarı alarmı görüntüler.
- Son olarak, çipi yıkayın. Rejenerasyon solüsyonunu çipten aspire edin ve çipe 50 μL yıkama tamponu (1x PBS; pH = 7.4) uygulayın. Çözeltiyi çipten aspire edin ve bu 5x'i tekrarlayın. Yıkama tamponunun son damlasını çip üzerinde bırakın ve Devam düğmesine basın ve yazılım ekranında yıkama adımı süresi bitene kadar 30 saniye bekleyin.
NOT: Yazılım, deneyin bir sonraki döngüsüne devam etmek için bir uyarı alarmı ile yıkama adımının son noktasını (30 sn) görüntüler.
- Kullanılan her analit konsantrasyonu için adımları tekrarlayın; kalibrasyon, analit ilişkilendirme, ayrışma, rejenerasyon ve yıkamanın beş adımı (5x) bir döngü oluşturur. Burada gösterilen deney için, 10 analit konsantrasyonu için 10 döngü gerçekleştirdik (25 nM ila 5.000 nM veya 0.4 nM ila 200 nM arasında değişen; Şekil 1).
