Biyomoleküler Etkileşim Tespit Teknikleri

Bu videoda, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve ölçmek için alan etkili biyoalgılama (FEB) teknolojisini açıklıyoruz. Grafen biyosensörü üzerinde hareketsiz hale getirilen hedef proteinler, çözeltideki analit proteinleri ile etkileşime girerek FEB sisteminde elektrik akımı değişikliklerine neden olur. Elektriksel tepkideki bu değişiklik, proteinler arasındaki bağlanma afinitesini gösterir.

Bu videoda, bir akış odasındaki antijen-antikor etkileşimlerini incelemek için kütle fotometrisinin kullanımını gösteriyoruz. Odaklanmış ışık, moleküllerin kütlesine bağlı olarak farklı şekilde dağılır. Bir dedektör, saçılan ışığı toplar ve moleküler kütlelerle ilişkili olan çeşitli yoğunluklarda noktalar olarak girişim modelini oluşturur.

Video, floresan proteinler, bir donör eGFP ve alıcı mCherry ile etiketlenmiş sitoplazmik proteinleri eksprese eden canlı bakterilerde protein-protein etkileşimini belirlemek için FLIM-FRET görüntüleme tekniğini açıklar. Kombine teknik ayrıca etkileşen proteinlerin miktarının belirlenmesine de izin verir.

Bu videoda, HEK hücre agregasyon testi yoluyla sinaptik hücre adezyon molekülleri arasındaki hücre içi etkileşimleri ölçme tekniğini gösteriyoruz. Bu tahlilde, istenen bir presinaptik hücre adezyon molekülünü ve bir floresan proteini eksprese eden eşit sayıda HEK hücresi, bir post-sinaptik hücre adezyon molekülü ve başka bir floresan proteini eksprese eden HEK hücreleri ile karıştırılır. Hücre adezyon molekülleri arasındaki etkileşim, hücreleri floresan mikroskobu ile ölçülebilen toplanmaya...

Bu video, nematod hücrelerinde in situ protein-protein etkileşimlerini incelemek için yakınlık ligasyon testini açıklar. İlgilenilen proteinlerin yakınlığı, ikincil bir antikora bağlı bir PLA probu yardımıyla dairesel DNA şablonunu oluşturur. Prob, hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin lokalizasyonunu sağlayan uzun tek sarmallı bir DNA ve ardından dedektör probunun hibridizasyonunu üreten amplifikasyon çözeltisi kullanılarak daha da büyütülür.

Bu video, protein-protein etkileşim analizi için bir PVDF membranı üzerinde birlikte immünopresipite protein komplekslerini göstermektedir. Komplekslerden indirgenmiş proteinler, daha küçük peptitlerde tek tek proteinleri parçalamak için tripsin ile muamele edildi, daha sonra kalan peptitler PVDF zarından ekstrakte edildi. Kompleksteki her iki proteinden türetilen çekilen peptit daha sonra kurutuldu ve daha fazla analiz için düşük bir formik asit konsantrasyonunda yeniden süspanse edildi.

Bu videoda, ligandlar ve hedef analitler arasındaki moleküller arası etkileşimleri gerçek zamanlı olarak tespit etmek için biyokatman interferometrisi (BLI) teknolojisini gösteriyoruz. BLI, çözelti içindeki analitlerle etkileşime girerken bir biyosensör yüzeyi üzerindeki hareketsizleştirilmiş ligandlardan oluşan bir tabakadan yansıyan beyaz ışığın girişim modelindeki değişiklikleri ölçer.

Bu video, hücre-hücre temaslarında hücre yüzeyi proteinleri arasındaki etkileşimi tespit etmek için floresan dalgalanma spektroskopisinin kullanımını göstermektedir. Bir floresan proteini ile etiketlenmiş ilgilenilen transmembran yapışma reseptörünü eksprese ederek ve spektral olarak ayrılmış iki floresan etiketi barındıran iki farklı hücre popülasyonunu karıştırarak, farklı renkli floresan ile iki komşu hücrenin reseptörleri arasındaki trans-etkileşim, floresan yoğunluğundaki dalgalanmalardaki...

Bu videoda, anti-GFP antikorları ile kaplanmış boncuklar kullanarak GFP etiketli vahşi tip ve mutasyona uğramış PD-1 proteinlerinin ko-immünopresipitasyonunu gerçekleştirmek için bir teknik gösteriyoruz. Boncuk bağlı PD-1-GFP proteinleri, PD-1 ile etkileşime giren SHP2 proteinleri ile inkübe edilir ve PD-1'de SHP2 etkileşiminde kritik bir rol oynayan spesifik yapısal motiflerin tanımlanmasını sağlar.

Bu videoda, ikinci proteinin hareketsiz hale getirilmiş birinci proteine bağlanmasını ölçerek iki protein arasındaki protein-protein etkileşimlerini tespit eden ELISA tabanlı bir teknik açıklanmaktadır. Bağlı ikinci protein, yaban turpu peroksidaz gibi bir enzim ile etiketlenmiş spesifik antikorlar kullanılarak tespit edilir.

Bu video, bir antikorun bir dönüştürücü çip üzerinde hareketsiz hale getirilmiş bir hedef antijen ile etkileşimini incelemek için iletken bir biyosensör testini göstermektedir. Biyosensör, iki işlevli bir kimerik proteine sahip olacak şekilde tasarlanmıştır - hareketsizleştirilmiş hedef antijene bağlanmak için bir nano gövdeye kaynaşmış fonksiyonel bir katalitik bölgeye sahip bir β-laktamaz enzimi. Bağlanma üzerine, bir antibiyotik substratının β-laktamaz enzimi tarafından katalitik hidrolizi,...

Bu videoda, hücre içi protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için biyotinile hücreye nüfuz eden peptitlerin kullanıldığı bir teknik gösterilmektedir. Hücreye nüfuz eden peptitler, konjuge peptitin bir hücreye girmesini ve spesifik olarak etkileşen proteinlerine bağlanmasını kolaylaştırır. Biotin, avidin'e bağlandıktan sonra, etkileşen proteinlerin kompleksinin bir hücre lizatından saflaştırılmasına izin verir.

Bu video, belirli protein öz etkileşimlerini tespit etmek için maya iki hibrit testini göstermektedir. Bu tahlilde, ilgilenilen protein, β-galaktosidaz enzimini kodlayan bir transkripsiyon faktörünün iki alanına etiketlenir. İki protein etkileşime girdiğinde, bu, daha sonra bir biyokimyasal tahlil kullanılarak tespit edilen enzimi oluşturmak için transkripsiyon ve translasyona neden olur.

Bu video, protein-protein etkileşimini incelemek için ökaryotik hücrelerden protein komplekslerini saflaştırmaya yönelik bir teknik olan tandem afinite saflaştırmasını göstermektedir. Kompleks, farklı epitop etiketleriyle etiketlenmiş iki protein içerir. Kompleksin, iki farklı etiket için bir afiniteye sahip iki reçine kullanılarak sıralı bir şekilde saflaştırılması üzerine, elütede her iki proteinin varlığı, ikisi arasındaki etkileşimi doğrular.

Bu video, bir sensör çipi kullanarak iki molekül arasındaki etkileşimi incelemek için yüzey plazmon rezonansı veya SPR tekniğini açıklar. Rezonans açısındaki değişiklik ve yansıyan ışığın yoğunluğu, iki molekülün birleşmesi ve ayrışmasının bir fonksiyonu olarak algılanır ve bu, iki molekül arasındaki etkileşimler hakkında bilgi sağlar.

Bu video, 15N etiketli vahşi tip ve mutant envoplakin proteini ile etiketlenmemiş vimentin proteini arasındaki protein-protein etkileşimlerini incelemek için nükleer manyetik rezonans spektroskopisi tekniğini açıklar. Yabani tip envoplakin ve vimentin arasındaki başarılı etkileşim, NMR spektrumlarında geniş çizgi genişlemesine ve tepe kaybolmasına yol açarken, mutasyona uğramış envoplakin ve vimentin arasında bir etkileşimin olmaması, NMR spektrumlarında iyi çözülmüş zirvelere neden olur.

Bu videoda, hedef proteine yüksek afiniteye sahip proteinleri ifade eden önceden tasarlanmış fajları izole etmek için faj görüntüleme tekniğini gösteriyoruz.

Bu video, protein homo-oligomerizasyonunu incelemek için floresan dalgalanma spektroskopisi (FFS) tekniğini göstermektedir. Bir numunedeki floresan etiketli proteinler, FFS kullanılarak protein oligomerizasyonu incelenirken bir ajan kullanılarak dimerize edilir. Konfokal bir mikroskop kullanılarak, proteinler küçük gözlem hacmine girip çıktıkça, proteinlerin oligomerik durumunu belirlemek için floresan moleküllerinin parlaklığındaki dalgalanmaların analizi yapılır.

Bu videoda, protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek için fotoaktif lokalizasyon mikroskobu ve bimoleküler floresan tamamlamasının bir kombinasyonu olan BiFC-PALM açıklanmaktadır. BiFC, iki floresan protein fragmanının, ilgilenilen iki etkileşimli protein ile füzyonunu içerir. İki protein etkileşime girdiğinde, parçalar yakınlaştırılır, bu da iki parçanın bir araya gelmesine ve işlevsel bir floresan proteini yeniden oluşturmasına izin verir. Tek bir floroforun floresansı, PALM tarafından...

Bu videoda, florofor etiketli Shwachman-elmas sendromu (SBDS) proteini ile uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimleri incelemek için floresan anizotropi tekniğini açıklıyoruz. SBDS proteinlerinin kademeli olarak artan EFL1 konsantrasyonları ile inkübe edilmesinde, iki protein arasında başarılı bir etkileşime işaret eden anizotropide sabit bir artış gözlenir.

Bu videoda, etiketlenmemiş aşırı eksprese edilmiş proteinler ve küçük moleküller arasındaki protein-ligand etkileşimlerini incelemek için hücre içi nükleer manyetik rezonans spektroskopisi tekniğini gösteriyoruz. Başarılı ligand-protein etkileşimi, orijinal zirvelerin yerini alan spektral ilgi bölgesinde ek bir tepe kümesinin ortaya çıkmasıyla görsel olarak doğrulanır.

Bu video, T7 faj ile görüntülenen peptit kütüphanesinin QCM biyosensör tabanlı biyopanlamasını kullanarak protein-ilaç etkileşimlerini incelemek için bir yöntemi göstermektedir. QCM biyosensöründe spesifik bir peptit gösteren fajların biyopanlanması, yüksek afiniteli peptitlerin spesifik izolasyonuna ve ardından hedef protein üzerindeki spesifik etkileşim bölgelerinin belirlenmesine yardımcı olan amino asit dizilimine izin verir.

Bu videoda, boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve çok açılı ışık saçılımı (MALS) yeteneklerinden yararlanan SEC-MALS açıklanmaktadır. SEC-MALS'de SEC, proteinleri veya protein komplekslerini boyutlarına göre ayırır ve MALS dedektörü, molekül tarafından farklı açılarda saçılan ışığın yoğunluğunu ölçerek ortalama moleküler ağırlığı belirler.

Bu videoda, konformasyona özgü tek alanlı antikorlar kullanarak spesifik protein dimerlerini tespit etmek ve izole etmek için bimoleküler tamamlama afinite saflaştırmasını, BiCAP'i gösterdik.

Bu videoda, CXCR4 hedefleyen küçük bir molekülün varlığında CXC Kemokin Reseptörü 4 (CXCR4) ile floresan etiketli doğal ligandı CXC Kemokin Ligand 12 (CXCL12) arasındaki etkileşimleri tespit etmek için akış sitometrisine dayalı rekabetçi bir bağlanma testini açıklıyoruz. CXCR4 eksprese eden hücrelerin daha düşük küçük molekül konsantrasyonları ile inkübe edilmesi, CXCR4-CXCL12'nin bir dereceye kadar bağlanmasına izin verir, bu da küçük molekül konsantrasyonlarında kademeli bir artışla kademeli...

Bu video, reseptör-ligand etkileşiminin raportör testine dayalı tespitini göstermektedir. Başarılı reseptör-ligand etkileşimi, aşağı akış sinyal yolunu aktive ederek, çözelti içinde salgı raportör molekülleri olarak sitokinlerin üretilmesine ve salınmasına neden olur, bu da ELISA kullanılarak doğrulanır.

Bu videoda, reseptörler ve ligandlar arasındaki kuvvetleri ölçmek için biyomembran kuvvet probları (BFP'ler) kullanılmıştır. Bu teknik, prob boncukları üzerinde konjuge edilen pMHC ile hedef hücreler üzerindeki TCR'ler arasındaki bağları kırmak için gereken basıncı izleyerek etkileşimleri tespit edebilir.

Bu video, GTPaz bağlayıcı protein ortaklarını incelemek için bir rekabet testini göstermektedir. Manyetik boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş nükleotid bağlı GTPaz proteini kullanılarak, GTPaz üzerindeki aynı bağlanma bölgesi için etkileşen iki protein ortağı arasındaki rekabetçi bağlanma, protein ortaklarının bağlanma afinitelerini değerlendirmek için incelenebilir.

Bu videoda, influenza virüsü suşlarının antijenik alt tipleriyle basılmış bir mikrodizi slaytı kullanarak birden fazla insan serum örneğinde antikor izotiplerini tespit etme sürecini gösteriyoruz.

Bu videoda, kızılötesi floresan etiketli DNA probları kullanarak protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için elektroforetik hareketlilik kaydırma testini gösteriyoruz. Protein DNA probuna bağlandığında, yavaşça hareket eden ve jel üzerinde kaymış bir bant olarak görünen büyük bir kompleks oluşturur.

Bu videoda, proteine bağlı kromatin fragmanlarının seçici immünopresipitasyonu yoluyla oligodendrosit öncü hücrelerinin genomik DNA'sının belirli bölgelerindeki protein bağlanma bölgelerini tanımlamak için kromatin immünopresipitasyon tekniğini gösteriyoruz. Bu yöntem, gen regülasyonunda yer alan transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere çeşitli düzenleyici proteinlerin etkileşimini incelemeye yardımcı olur.

Bu videoda, transkripsiyon faktörleri ve DNA arasındaki etkileşimi izlemeye yardımcı olan yüksek performanslı floresan anizotropisi açıklanmaktadır. Test, florofor etiketli DNA'nın moleküler rotasyonu veya anizotropisine bağlı polarizasyon derecesini ölçerek, florofor etiketli bir DNA molekülünün spesifik transkripsiyon faktörü ile etkileşimlerini izler.

Bu video, RNA bağlayıcı proteinlerin (RBP'ler) RNA ile etkileşimini incelemek için bakterilerde in vivo bir testi göstermektedir. Bakteri hücreleri iki plazmit yapısı ile dönüştürülür - bir RBP bağlanma bölgesinin aşağı akışında bir floresan raportör geni içeren bir mRNA'yı kodlayan bir bağlanma bölgesi plazmidi - bir RBP plazmidi, bir indükleyicinin kontrolü altında RBP proteinlerini ifade eder. RBP üretiminde indükleyici aracılı artış üzerine, RBP'ler mRNA'ya bağlanır ve ribozom bağlanmasının...

Bu videoda, hedef DNA ile etkileşime giren birden fazla proteini tespit eden modifiye maya tek hibrit testini gösteriyoruz. Dönüştürülmüş maya hücreleri, raportör genin yukarı akışındaki hedef DNA dizisini içerir. Ek olarak, transkripsiyon faktörü proteinlerini eksprese ederler. Proteinler kompleksler oluşturduğunda ve hedef DNA'ya bağlandığında, raportör gen eksprese edilir ve enzimatik olarak tespit edilebilir.

Bu videoda, biotin etiketli dsRNA substratını çözmek için bir hedef proteinin helikaz aktivitesini belirleme prosedürünü gösteriyoruz. Enzimin aktivitesi, elektroforetik hareketlilik kaymasının analiz edilmesiyle ve ardından kemilüminesans enzim konjuge streptavidin kullanılarak bir kemilüminesans deneyi ile tanımlandı.

Bu videoda, ışınlanmış hücre çekirdeğindeki çift sarmallı DNA kırılma bölgelerinde DNA onarım proteinleri γH2AX ve 53BP1'in lokalizasyonunu görselleştirmek için immünofloresan yöntemini açıklıyoruz.

Bu video, mRNA'daki adenilat-üridilat açısından zengin element (ARE) dizileri ile etkileşime giren RNA bağlayıcı proteinleri (RBP'ler) tanımlamak için bir in vitro RNA aşağı çekme testini göstermektedir. Bir hücre lizatından gelen hedef RBP'ler, RNA-protein kompleksleri oluşturmak için bir RNA probu ile karıştırılır. Kompleksler, RNA probunun destiyobiyotin etiketinin streptavidin etiketli bir manyetik boncuğa afinitesi kullanılarak afinite saflaştırması yoluyla izole edilir.

Bu videoda, ilgilenilen bir hedef protein için spesifik RNA bağlama dizilerini tanımlamak için üstel zenginleştirme (SELEX) yöntemiyle ligandların sistematik evrimini açıklıyoruz. Protein, geniş bir randomize RNA dizileri havuzu ile inkübe edilir ve protein bağlayıcı RNA dizileri izole edilir, PCR ile çoğaltılır ve protein bağlama bölgelerini tanımlamak için dizilenir.

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

Bu video, bir biyomolekül ve bir ligand arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılan bir teknik olan diferansiyel taramalı kalorimetriyi göstermektedir. Bir DNA aptamer ve bir termolabil ligandın bağlanması, numuneye tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngüleri uygulanarak ve termodinamik analiz için taramalar elde edilerek incelenir.

Bu video, protein-lipid etkileşimini incelemek için mikro ölçekli termoforezi göstermektedir. Tahlil, bir sıcaklık gradyanına yanıt olarak floresan etiketli proteinlerin termoforetik hareketini ölçerek moleküller arasındaki etkileşimi tespit eder. Floresan molekülü, floresan olmayan lipid moleküllerinin farklı konsantrasyonları ile karıştırılır ve çözeltideki moleküllerin karışımı kılcal damarlara yüklenir. Kılcal damarlardaki numunelere bir sıcaklık gradyanı uygulanır ve floresan molekülünün...

Bu videoda, kantitatif akış sitometrisi kullanarak proteinler ve yapay fosfolipid veziküller arasındaki etkileşimi gösteriyoruz. Floresan etiketli proteinlerin floresan etiketli fosfolipid veziküllere bağlanması, ortalama floresan yoğunluğunu arttırır ve bu artış bir akış sitometresi ile tespit edilir.

Bu video, proteinlerin lipid çift katmanlarına bağlanmasını araştırmak için enerji tüketen bir mikrogravimetri tekniğini göstermektedir. Bir mikroterazinin kuvars sensörünün yüzeyini kaplamak için küçük tek parçalı veziküller eklenir. Hedef fosfolipid bağlayıcı proteinin çift tabakaya kalsiyum iyonuna bağlı bağlanması kullanılarak, protein-lipid çift tabaka bağlanmasının doğasını belirlemek için sensörün salınım frekansındaki değişiklikler ve salınımın dağılımı izlenir.

Bu videoda, mikroakışkan platform adı verilen, desteklenen bir lipid çift tabakasının fosfatidiletanolamin lipidine etiketlenmiş pH'a duyarlı floresan boya kullanarak, pH modülasyon testini kullanarak mikroakışkan bir modelde protein-fosfoinositid etkileşimlerini gösteriyoruz. Proteinin fosfolipide bağlanmasından sonra pH'daki modülasyonlar floresan söndürmeye neden olur.