1. Akış odalarını hazırlayın
- Cam lamellerin temizlenmesi
- Damıtılmış su, etanol ve izopropanol içeren yıkama şişelerini kullanarak 24 mm x 50 mm'lik lamelleri şu sırayla durulayın: su, etanol, su, izopropanol, su. Lamelleri temiz bir nitrojen akışı ile kurulayın. Lamelleri yukarıdan aşağıya doğru, alt köşeyi yumuşak uçlu forseps ile tutarak durulamak önemlidir. Forsepsten kontaminasyonun aktarılmasını önlemek için lamel aynı yönde kurutun (Şekil 1A).
- Benzer şekilde, 24 mm x 24 mm lamelleri damıtılmış su, etanol ve damıtılmış su ile durulayın. Lamelleri temiz bir nitrojen akışı ile kurulayın.
- Lamelin çalışma tarafını belirleyin, temiz lamel yüzeyine bir damla damıtılmış su koyun ve protokolün 3.1–3.2 adımlarını izleyin. Genellikle, 24 mm x 50 mm lamel in sadece bir tarafı MP ölçümleri için uygun optik kaliteye sahiptir.
not: Odaklamadan sonra, önemli bir yüzey kusuru tespit edilmemeli ve veri toplama yazılımında gösterilen "sinyal" değeri %0,05'ten az olmalıdır (Şekil 2A-C). Kutudaki tüm lamellerin çalışma tarafları aynı yönde yönlendirilmiştir. Lamel temizliğinin verimliliğini test etmek için aynı prosedür kullanılmalıdır.
- Akış odasını monte edin
- 24 mm x 24 mm lamel bir parça alüminyum folyo üzerine yerleştirin. Şekil 24B'de gösterildiği gibi 24 mm x 1 mm lamelanın üzerine çift taraflı bant şeritleri yerleştirin ve bandı camın kenarı boyunca kesin. Lameli alüminyum folyodan ayırın ve 24 mm x 50 mm lamel çalışma tarafına takın (Şekil 1C).
not: Kanal boyutu değişebilir, ancak 3 mm–5 mm genişlik önerilir. Daha geniş kanallar daha büyük numune hacimleri gerektirir ve çok dar kanalların yüklenmesi zor olabilir. Genellikle, 24 mm x 24 mm lamel üzerinde iki paralel kanal kolayca oluşturulabilir. Protokol burada duraklatılabilir.
2. Afinite ölçümleri için antikor-antijen örneklerini hazırlayın
- Toz parçacıklarını veya agregaları temizlemek için 0,22 μm şırınga filtreleri kullanarak PBS tamponunun en az 2 mL'sini filtreleyin. Protein stoğunu masa üstü santrifüjün maksimum hızında (yaklaşık 16.000 x g) 10 dakika santrifüjleyin.
not: PBS, bu protokol için önerilen tampondur, ancak MP'nin belirli bir tampon gereksinimi yoktur ve diğer biyolojik tamponlar da kabul edilebilir. Bununla birlikte, yüksek gliserol konsantrasyonları (%>10) ve çok düşük iyonik kuvvetler (tuz konsantrasyonu <10 mM) görüntü ve veri kalitesini etkileyebilir ve önerilmez.
- 280 nm UV absorbanslarını ölçerek antikor ve antijen stoklarının gerçek konsantrasyonlarını belirleyin.
- Antijen-antikor karışımının ölçülen konsantrasyonlarını hesaplayın. Antikor bağlanma afinitesinin tahmini değeri bilinmiyorsa, 30 nM antijen ve 20 nM antikor konsantrasyonuna sahip bir numune hazırlamayı planlayın. Yaklaşık afinite bilindiğinde, antikor-antijen oranı ve konsantrasyonları beklenen KDdeğerlerine göre optimize edilmelidir. Karışımdaki toplam antijen konsantrasyonunu, beklenen Kd ve aşağıdaki denklemdeki toplam antikor konsantrasyonunun toplamına eşit olarak kullanın. Antikorun iki paratopu için Kd1 = Kd2 olduğunu varsayarsak, bu, numunedeki serbest antikorun ve antikor-antijen komplekslerinin karşılaştırılabilir konsantrasyonları ile sonuçlanacaktır.
Numunedeki toplam protein konsantrasyonunu 10 nM ve 50 nM aralığında tutmak için antikor konsantrasyonunu ayarlayın. En iyi sonuçlar, 5 nM ile 25 nM.
arasında antikor konsantrasyonlarına sahip karışımlar kullanılarak elde edilir.
not: MP, moleküler kütlesi 40 kDa'dan büyük olan proteinleri tespit eder. Sonuç olarak, moleküler kütlesi 40 kDa'dan küçük olan antijenlerin örnek konsantrasyonları, tipik 50 nM sınırını aşabilir. Bununla birlikte, yaklaşık 100 nM'den daha yüksek konsantrasyonlarda, düşük moleküler kütleli antijenler bile Kd tayininin görüntü kalitesini ve doğruluğunu etkileyebilir.
- Adım 2.3'te hesaplanan son ölçüm konsantrasyonunda 50 μL antikor-antijen karışımı hazırlayın.
not: Kd tayini için antijen-antikor karışımının sadece bir örneği gereklidir. Bununla birlikte, farklı antijen-antikor oranlarına sahip birkaç numune hazırlamak, numune konsantrasyonunu optimize etmeye yardımcı olabilir. Birkaç numuneden veri toplanırsa, bunlar küresel bir uyum yoluyla analiz edilebilir.
- Bağlanma reaksiyonunun kimyasal dengeye ulaşmasını sağlamak için antijen-antikor karışımlarını oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika inkübe edin. Gereksiz yere uzun inkübasyon sürelerinden kaçının.
not: Kuluçka süresi, bağlanma kinetiğine bağlı olarak değişebilir. Kimyasal dengeye ulaşıldığını doğrulamak için, numune ölçümleri farklı inkübasyon sürelerinde tekrarlanabilir. Zamanla değişmeyen Kd değerleri yeterince uzun inkübasyonu gösterir. Uzun süreli inkübasyon, plastik laboratuvar gereçlerinin yüzeyine önemli ölçüde protein adsorpsiyonuna ve sonuç olarak protein konsantrasyonunun belirlenmesinde önemli hatalara yol açabilir. Bu nedenle, MP numune hazırlama için düşük yapışma özelliğine sahip laboratuvar gereçleri şiddetle tavsiye edilir.
3. Kütle Fotometrisi verilerini toplayın
- MP cihaz objektifine bir damla mikroskop daldırma yağı sürün ve monte edilmiş akış odasını mikroskop tablasına yerleştirin. Yağın lamel ile objektif arasındaki boşluğu kapladığından emin olun.
- Akış odasını yükleyin ve kütle fotometresini odaklayın.
- Adım 1'de hazırlanan akış odası kanalının bir ucunda 10 μL temiz, filtrelenmiş bir tampon çözeltisi biriktirin. Sıvı, kılcal hareket ile kanala girecektir.
- Mikroskobu 24 x 50 mm lamel çalışma yüzeyine odaklamak için sahnenin Z konumunu ayarlayın.
- Veri toplama yazılımının Odak Kontrolü sekmesinde, ilk ayarlamaları yapmak için kaba sahne hareketi Yukarı ve Aşağı düğmelerini kullanın.
- Netlik sinyali okumasını göstermek için Keskinlik düğmesine tıklayın ve Keskinlik değerini en üst düzeye çıkarmak için ince Yukarı ve Aşağı ayar düğmelerini kullanın.
- Odak izleme işlevini etkinleştirmek için Odağı Ayarla ve Odağı Kilitle düğmelerine tıklayın. Düzgün odaklanmış bir görüntü (Şekil 2A, C) %0,05'in altında bir "sinyal" değerine sahip olmalıdır.
not: Maksimum keskinlik konumundaki "sinyal" değeri %0,05'in üzerindeyse, bu cam yüzeyindeki veya tampondaki kirleri gösterebilir.
- Aynı kanalı kullanarak, 20 μL antikor-antijen örneğini kanalın bir tarafına bırakarak ve sıvıyı diğer ucundan küçük bir kurutma kağıdı parçasıyla lekeleyerek yükleyin (Şekil 1D).
not: 3-5 mm genişliğindeki bir kanalın hacmi yaklaşık 10 μL'dir. Kanalda bulunan tamponun tamamen değiştirilmesi ve numunenin seyreltilmesini önlemek için ek numune hacmi önerilir.
- Örneği yükledikten sonra, 100 sn'lik bir video elde ederek veri toplamaya başlamak için hemen Kaydet düğmesine tıklayın (Şekil 2D).
- Veri toplamanın sonunda, dosya adını girin ve veri dosyasını kaydetmek için Tamam'ı tıklatın.
- Lamelleri atın ve objektif merceğindeki yağı, izopropanol ile ıslatılmış pamuklu optik çubuklarla silin.
not: Protokol buradan duraklatılabilir.
4. MP verilerini analiz edin
- İniş olaylarını tanımlamak için MP veri işleme yazılımını kullanarak toplanan video dosyasını işleyin.
- Analiz için dosyayı yüklemek üzere Dosya/Aç menü seçeneğini kullanın ve Analiz Et'e tıklayın.
- Kalibrasyon işlevini yüklemek için Yükle düğmesine tıklayın ve analiz edilen verileri Dosyala/Sonuçları Farklı Kaydet menü seçeneğini kullanarak kaydedin.
- Numunedeki her bir türün nispi konsantrasyonlarını elde etmek için moleküler kütle dağılımını Gauss fonksiyonlarıyla eşleştirin. Bu analiz, yaygın bir bilimsel grafik yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir (bkz.
- "eventsFitted.csv" dosyasını yazılıma aktarın ve Çizim/İstatistik/Histogram işlevini kullanarak moleküler kütle dağılımını (.csv dosyasındaki M sütunu) çizin.
- Plot Properties (Çizim Özellikleri) penceresini açmak için histograma çift tıklayın. Otomatik gruplamayı devre dışı bırakın ve 2,5 kDa'lık bir bölme boyutu seçin. Bin Merkezleri ve Sayımları verilerini oluşturmak için Uygula ve Git düğmelerine tıklayın.
- Bölme Merkezleri ve Sayımlar sütunlarını seçin ve histogramı Gauss işlevleriyle eşleştirmek için Analiz/Tepeler ve Temel/Çoklu Tepe Sığdırma menü işlevini kullanın. Dağılım grafiğindeki yaklaşık tepe konumlarını belirtmek için çift tıklayın ve ardından NLFit'i Aç düğmesine tıklayın.
- "xc" tepe merkezleri için Sabit onay kutularını işaretleyin ve değerlerini serbest antikorun beklenen moleküler kütlelerine ve tek ve çift antijen-antikor komplekslerine ayarlayın. Genişlik parametreleri için Paylaş seçeneğini işaretleyin. Sığdır düğmesini tıklayın. Gauss bileşenlerinin takılan tepe yükseklik değerleri, numunedeki her bir türün nispi konsantrasyonunu temsil eder.
not: Yığın boyutu, yığın dağılım grafiğinin çözünürlüğünü optimize etmek için ayarlanabilir. MP hassasiyet sınırı yaklaşık 1 kDa'dır ve daha küçük kutu boyutları, herhangi bir ek bilgi açığa çıkarmazken dağıtımın gürültüsünü artırabilir. Çok büyük kutu boyutları, toplu dağıtımların ince ayrıntılarını gizleyecektir.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak her türün konsantrasyon fraksiyonunu hesaplayın:
burada HI ve FI değerleri, numunedeki serbest antikorun ve tek ve çift bağlı antikorun sırasıyla tepe yüksekliklerini ve konsantrasyon fraksiyonlarını temsil eder.
