$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Agaroz pedinin hazırlanması (Şekil 1)
- Düz bir yatay yüzeye bir mikroskop cam lamı yerleştirin. İlk slaytın her iki tarafına iki kat yapışkan bant ile kaplanmış iki cam slayt yerleştirin.
not: Erimiş agarozun yapışkan bantla slaytlara yayılmasını önlemek için hizalanmış üç slayt arasında 1-2 mm boşluk bırakın.
- Pipetleyin ve cam slayt üzerine 70 μL% 1 erimiş agarozdan oluşan bir damla dökün. Agaroz damlacığını düzleştirmek için üstüne dördüncü bir slayt ekleyin ve hafifçe aşağı bastırın. Yaklaşık bir dakika bekleyin.
- Üst sürgüyü çıkarın ve yaklaşık 3 μL bakteriyi bir pipetle agaroz pedinin üzerine farklı yerlerde 3 ila 4 noktaya bırakın.
- Mikroskopi camı lamel ile örtün (örneğin 22x22 mm #1.5 kalınlık).
not: Lamellerin düzlüğü ve kalınlığı, iki fotonlu uyarımlarla çalışmak için önemlidir. Kontrollü düzgün düzlüğe ve düşük otofloresansa sahip hassas lameller genellikle iyi bir seçimdir.
- Lameli cam kızağa yapıştırmak için lameli erimiş parafin ile sabitleyin. Lamelin dört köşesini sabitleyerek başlayın.
2. İki foton mikroskobu kurulumu ile görüntüleme
NOT: Taranmamış floresan toplama modunda çalışan 60x 1.2NA suya daldırma objektifine sahip, ev yapımı iki fotonlu uyarma taramalı ters mikroskop kullanıyoruz. İki foton uyarma dalga boyu 930 nm olarak ayarlanmıştır. 10-20 mW'da çalışan bir Ti:Sapphire lazer (80 MHz tekrarlama oranı, ≈ 70 fs darbe genişliği) ile sağlanır. Floresan fotonlar, zamanla ilişkili tek foton sayma (TCSPC) modülüne bağlı fiber bağlantılı bir çığ foto-diyotuna yönlendirilmeden önce 680 nm kısa geçiren bir filtre ve 525/50 nm bant geçiren bir filtre aracılığıyla toplandı. Mikroskop ayrıca bir transmisyon floresan lambası ile donatılmıştır. Birkaç FLIM-FRET mikroskobu artık ticari olarak temin edilebilir ve birçok görüntüleme tesisi FLIM-FRET ölçümlerini gerçekleştirebilen kurulumlarla donatılmıştır.
- Objektifi numunedeki tek bakteri tabakasına odaklamak için floresan lambayı kullanın ve ilgilenilen bölgeleri seçin.
- Uyarma lazer deklanşörünün kapalı olduğunu ve lazerden gelen kızılötesi ışığın engellendiğini ve mikroskoba girmediğini kontrol edin.
Dikkat: Lazer ışığı gözler tarafından görülemediğinden, IR darbeli lazerlerle çalışırken dikkatli olunmalı ve sürekli tetikte olunmalıdır, ancak herhangi bir ve hatta geçici doğrudan maruz kalma veya lazer yansıması son derece zararlı olabilir ve geri dönüşü olmayan göz hasarı yaratabilir. Mikroskopi kurulumlarını kullanmadan önce lütfen yerel lazer güvenlik prosedürlerine ve eğitimine bakın.
- Mikroskopi slaytını, lameller objektife bakacak şekilde sahneye yerleştirin.
- Floresan lambasının AÇIK olduğunu kontrol edin.
- eGFP küpünü seçmek için filtre küpü taretini çevirin ve floresan lamba kapağını açın.
- Floresan ışığını mikroskobun göz merceğine doğru gönderin.
Dikkat: Floresan lambasından gelen ve gözlere zarar verebilecek doğrudan uyarma ışığını atmak için ışık yoluna uygun filtrelerin atıldığından emin olun.
- Mikroskop düğmesini kullanarak hedefi bakterilere odaklayın.
- Motorlu tablayı kontrol eden joystick'i kullanarak çevirerek örnekte ilgilendiğiniz bir bölgeyi seçin
not: Yüksek floresan numunelerle odaklama daha kolaydır ve floresanın doğrudan gözlerle görülmesini sağlar.
- FLIM-FRET ölçümleri için 2PE lazerin uyarmasını değiştirin.
- Floresan emisyon yolunu dedektöre doğru geri gönderin.
- 930 nm lazer için dikroik küpü seçmek için filtre küpü taretini geri çevirin.
- Lazer gücünü 20 mW'a ayarlayın.
- İlgilenilen bölgenin boyutunu 30 μm olarak ayarlayın. Bu işlem, galvo aynaları çalıştıran voltajı ayarlar ve hareket aralıklarını tanımlar (Şekil 2).
- Dedektörü açın ve numuneyi taramaya başlayın - taramayı kontrol eden başlat ve durdur düğmeleri, hem güvenlik nedenleriyle hem de numunenin fotoağartmasını sınırlamak için lazer deklanşörünün açılıp kapanmasını da kontrol eder (Şekil 2).
- Gerekirse, mikroskop ince odak düğmesini hafifçe hareket ettirerek odağı ayarlayın.
- Sahneyi bilgisayar arayüzünden hassas bir şekilde hareket ettirerek görüntüleme için görüş alanını seçin. Bu, görüntünün yeni merkezini tanımlayacak olan mikroskop kontrol yazılımında (Şekil 2) görüntü üzerindeki çarpı işaretini hareket ettirerek ve "Move Stage" düğmesine basarak kurulum üzerinde yapılabilir. Elde etmek için iyi bir görüş alanı, hepsi doğru odaklanmış 10-30 hareketsiz bakteri içeren bir görüntüye karşılık gelir (tüm bakteriler aynı düzlemdedir). Tek hücreli FLIM-FRET verilerini çıkarmakla ilgileniyorsanız, bakterilerin iyi bir şekilde bireyselleştirildiğinden emin olun (görüntü segmentasyonu çok daha kolay olacaktır).
