Hücre Adezyon Molekülleri Arasındaki Trans Etkileşimleri Tespit Etmek için Hücre Agregasyon Testi

Abstract

Kaynak: Restrepo, S., et al., Heterolog Hücre Sisteminde Protein Agregasyonu Yoluyla Hücre Arası Etkileşimlerin Ölçülmesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, HEK hücre agregasyon testi yoluyla sinaptik hücre adezyon molekülleri arasındaki hücre içi etkileşimleri ölçme tekniğini gösteriyoruz. Bu tahlilde, istenen bir presinaptik hücre adezyon molekülünü ve bir floresan proteini eksprese eden eşit sayıda HEK hücresi, bir post-sinaptik hücre adezyon molekülü ve başka bir floresan proteini eksprese eden HEK hücreleri ile karıştırılır. Hücre adezyon molekülleri arasındaki etkileşim, hücreleri floresan mikroskobu ile ölçülebilen toplanmaya zorlar.

Protocol

1. Hücre kültürü ve transfeksiyon

1. 4.5 g / L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ve% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM, 1x (Dulbecco'nun Eagle's Medium Modifikasyonu) ile HEK hücre ortamı yapın. Steril filtre.
2. Agregasyon testi için uygun ligandları ve reseptörleri önceden belirleyin.
   not: Bu çalışmada Neurexin3α SS4+/- ve bilinen ligandlarından biri olan LRRTM2 kullanılmıştır. İlgilenilen ligandlar ve reseptörler, pcDNA3.1'deki cDNA'lardan eksprese edildi. Neurexin3α'yı pcDNA3.1'e eklemek için bir Gibson düzeneği kullanıldı. Neurexin3α F / R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATCTGCAGAATTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. HEK293T hücreleri hazırlayın.
   1. Bir T-75 şişesinde birleşene kadar HEK293T hücreleri büyütün.
   2. Bir kez birleştikten sonra, 2 mL tripsin kullanın ve 2 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Hücreleri yeniden süspanse etmek için şişeye 6 mL HEK ortamı ekleyin ve 8 mL'nin tümünü 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
   3. 5 dakika boyunca 500 x g'da pelet ve toplam 8 mL boyunca HEK hücre ortamında yeniden süspanse edin.
   4. Hücreleri sayın ve 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 735.000 hücre ekleyin. HEK hücre ortamını kullanarak her kuyucuk için son hacmi 2 mL'ye ayarlayın.
   5. 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin gece boyunca veya% 50-60 birleşmeye ulaşana kadar büyümesine izin verin.
4. Kalsiyum fosfat yöntemini kullanarak HEK293T hücrelerini transfekte edin.
   1. İlgilenilen proteinin 3 μg'ı ile kuyu-1'i transfekte edin ve 1 μg floresan proteini (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- ve 1 μg mCherry) ile birlikte transfekte edin.
   2. Adım 1.4.1'deki gibi kuyu-2'yi transfekte edin. ancak ilgilenilen mutasyona uğramış protein (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-) ile.
   3. Kuyu-3'ü 3 μg ilgilenilen ligand ile transfekte edin ve 1 μg başka bir floresan proteini (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 ve 1 μg GFP) ile birlikte transfekte edin.
   4. Negatif kontroller olarak hizmet etmek için kuyu-4 ve kuyu-5'i transfekte edin: kuyu-4 1 μg GFP ile ve kuyu-5 1 μg mCherry ile.
   5. Ek koşullar veya kontroller gerektiriyorsa başka bir plaka hazırlayın (1.4.1-1.4.4 adımlarında olduğu gibi) (Neurexin3α^WT/A687T SS4+).
      not: Transfeksiyon verimliliği, transfeksiyondan 24 saat sonra bir epifloresan mikroskobu altında analiz edilir ve transfekte edildikleri floresan proteini ifade eden hücre sayısı olarak ölçülür. Daha aerodinamik bir yaklaşım, HEK hücrelerinin bir floresan proteini ve ilgilenilen ligandı kodlayan bir bisiztronik vektör ile transfeksiyonunu içerecektir ve ko-transfeksiyonun üzerinde şiddetle tavsiye edilir. Bu çalışma durumunda, alfa Nötreksinler ~ 4.3 kb'dir ve ko-transfeksiyon gerektiren bir bisistronik sistem kullanılarak düşük floresan yoğunluğu gözlenmiştir.
5. Transfeksiyondan 48 saat sonra, agregasyon için hücreleri hasat edin.
   1. Her kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın.
   2. Hücreden hücreye etkileşimleri nazikçe ayırmak için her bir oyuğa PBS'de 1 mL 10 mM EDTA ekleyin ve plakayı 37 ° C'de 5 dakika < br / > inkübe edin not: Çalışmadaki adezyon moleküllerinin potansiyel proteolitik bölünmesi nedeniyle adım 1.5.b için tripsin önerilmez. Ek olarak, EDTA ilavesinden sonra, hücreler artık ortam koşullarına maruz kalacağından, protokol tamamlanana kadar durdurulamayabilir.
   3. Hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe vurun ve her bir kuyuyu ayrı 15 mL konik tüplere hasat edin.
   4. Konik tüpleri 500 x g'da ve oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleyin.
6. Hücreler peletlenirken, her bir mikrosantrifüj tüpünün üstünü her koşulla etiketleyerek 6 inkübasyon tüpü hazırlayın.
   not: GFP ve mCherry koşullarının her permütasyonu, tüm deneysel koşulları ve uygun kontrolleri kapsayacak şekilde kullanılmalıdır. Örneğin: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mKiraz, 5. Neurexin3α^WT SS4-—mCherry / LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Daha fazla koşul ve kontrole uyum sağlamak için ek tüpler yapın.
7. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 37 ° C'ye ısıtılmış 10 mM CaCl₂ ve 10 mM MgCl₂ ile 500 μL HEK ortamında yeniden süspanse edin.
   not: CaCl₂ ve MgCl₂ ilavesi, adezyon moleküllerinin yeniden bağlanmaya izin verir ve yalnızca söz konusu transselüler etkileşim ortaklarının adezyon için iki değerlikli katyonlara ihtiyaç duyması durumunda gereklidir.
8. Bir hemositometre kullanarak her 15 mL konik tüpteki hücreleri sayın ve toplam 500 μL.
   hacminde 1: 1 karışım için her koşuldan 200.000 hücreyi 1.6. adımdan uygun bir tüpe ayırın not: Miktarları saymak ve alikot etmek koşul başına sadece 5 dakika sürmelidir.
9. Tüpleri yavaş bir tüp döndürücüde oda sıcaklığında inkübe edin.

2. Görüntü edinme

1. Belirli numuneler için mikroskop toplama parametrelerini optimize edin. Bu örnekte, görüntüler geniş alan mikroskobunda çekilmiştir. 5x hava hedefi kullanın (NA: 0.15; WD: 20000 μm) analiz için yeterince geniş bir alan elde etmek için.
2. Adım 1.8'de HEK hücrelerinin iki koşulunu karıştırdıktan hemen sonra temel toplamayı değerlendirin. Bunlar artık 'sıfır zamanı' görüntüleri.
   1. Her numune karışımından 40 μL'yi yüklü bir mikroskop lamına pipetleyin ve hem 488 hem de 561 kanallarında floresan altında görüntü alın.
   2. Her numune damlası için bir odak düzleminde üç farklı görüş alanı elde edin.
3. Son görüntüleri 60 dakikada 'zaman 60' görüntüsü olarak elde edin.
   1. 60 dakikalık bir inkübasyondan sonra karışımın 'zaman 60' görüntüsünü elde etmek için, dönen tüplerden her koşuldan 40 μL daha numune alın ve her numuneyi yüklü bir slayt üzerine pipetleyin. Adım 2.2.
      'deki gibi görüntü not: Hücre agregasyonu, doygunluk oluşana kadar her 15 dakikada bir kontrol edilmelidir. Agregasyonun zamanlaması, test edilen proteinlere bağlı olacaktır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL tek kullanımlık çıtçıtlı kapaklı mikrotüpler	VWR (VWR)	89000-028	HEK hücrelerinin karışık popülasyonunun inkübasyonu
1000 mL Hızlı Akış Filtre Ünitesi, 0,2 um aPES membran	Termo Balıkçı	567-0020	HEK ortamının sterilizasyonu
15 mL SpectraTube santrifüj tüpleri	Ward'ın Bilimi	470224-998	HEK hücrelerinin toplanması
6 oyuklu steril doku kültürü plakaları	VWR (VWR)	100062-892	HEK hücrelerinin kültürlenmesi
Kalsiyum Klorür	Sigma	223506-500G	Kalsiyum fosfat transfeksiyonu, HEK hücre resüspansiyonu
Santrifüj - Sorvall Legend RT	Kendro Laboratuvar Ürünleri	75004377	HEK hücrelerinin toplanması
CO2 hücre inkübatörü	Termo Bilimsel	HERACELL 150i	Büyüme sırasında HEK hücrelerinin inkübasyonu
DMEM, 4.5 g / L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ile 1x (Dulbecco'nun Eagle's Medium Modifikasyonu)	Corning	10-013-Özgeçmiş	HEK hücre bakımı
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuzlu PBS'si (1X)	Gibco (Gibco)	14190-144	HEK hücresinin geçirilmesi / toplanması
Etilendiamintetraasetik asit	Sigma	ED-500G	HEK hücrelerinin toplanması
Falcon Bacalı kültür şişeleri, 75cm2 büyüme alanı	Corning	9381M26	HEK hücrelerinin kültürlenmesi
Fetal Sığır Serumu	Sigma	17L184	HEK hücre bakımı
HEK293T hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)		Model sistemi
ResimJ	Nıh	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Görüntü analizi
Magnezyum Klorür hekzahidrat	Sigma	M9272-500G	HEK hücre yeniden süspansiyonu
Sodyum fosfat dibazik susuz	Fisher BiyoReaktifleri	BP332-500	Kalsiyum fosfat transfeksiyonu
Tripsin% 0.25 (1X) Çözelti	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	SH30042.01	HEK hücrelerinin geçirilmesi
Tüp döndürücü			HEK hücrelerinin karışık popülasyonunun inkübasyonu
UltraClear Mikroskop slaytları. Beyaz Buzlu, Pozitif Şarjlı	Denville Bilimsel A.Ş.	M1021	Görüntü elde etme
Geniş alan mikroskobu	Zeiss	Axio Dikey 200M	Görüntü elde etme