>NOT: Bu protokol, potansiyel etkileşimli ortakların her ikisinin de etiketlendiği C. elegans suşlarını kullanır. Etiketli bir proteinin başka bir etiketli aday etkileşim ortağı ile etkileşime girmesinin beklenmediği bir negatif kontrol suşunun kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Burada, DLC-1'in solucandaki GFP ile etkileşime girmesi beklenmediğinden, arka planı değerlendirmek için tek başına GFP negatif bir kontrol olarak kullanıldı. GFP etiketli OMA-1, ön veriler DLC-1 ile bir etkileşime işaret ettiği için deneysel suş olarak kullanıldı. 3xFLAG etiketli DLC-1 ile kontrol ve test proteinlerini birlikte eksprese eden nematod suşları bu metinde 3xFLAG::D LC-1 olarak anılacaktır; GFP ve 3xFLAG::D LC-1; OMA-1::GFP (suşlar istek üzerine temin edilebilir; daha fazla bilgi Malzeme Tablosunda). Burada 3xFLAG ve GFP etiketleri kullanılır; bununla birlikte, antikorları PLA kit reaktifleri ile uyumlu olduğu sürece diğer etiketler ikame edilebilir.
1. Hayvan bakımı
- Solucanları, E. coli'nin OP50 suşu ile tohumlanmış nematod büyüme ortamı (NGM) plakalarında tutun ve GFP'nin optimum ekspresyonu için 24 ° C'de tutun.
- Solucanları çoğaltmak ve iyi beslenmelerini sağlamak için her 2-3 günde bir yetişkin solucanları geçin.
2. Senkron kültürün hazırlanması
- İyi beslenmiş, gravid hermafroditlerden oluşan bir tabağı ağartarak solucanları senkronize edin. Porta-de-la-Riva ve ark.'da bir ağartma protokolü tanımlanmıştır. Embriyoların 24 ° C'de bir santrifüj tüpünde gece boyunca çatlamasına izin verin ve 10 mL M9 minimal ortam (M9) tamponunda uçtan uca döndürün. Bu, tutuklanmış L1 larvalarından oluşan bir kültür üretecektir.
- Tutuklanan L1 aşaması larvalarının tüpünü buz üzerinde 10 dakika inkübe edin, ardından tüpü buz gibi 1x M9 ile doldurun.
- Larvaları 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da peletlemek için bir santrifüj kullanın. Süpernatanı dikkatlice aspire edin, böylece sadece 1-2 mL süpernatan kalır.
- Larva peletini yeniden süspanse edin ve 2 μL asılı larva kültürünü bir cam slayta aktarmak için bir mikropipet kullanın. Larva kültürünün yoğunluğunu belirlemek için kaç tane larva bulunduğunu sayın, bu da adım 2.5.
'da solucanların tohumlanmasına rehberlik edecektir.
not: 10-15 L1 larva/1 μL yoğunluk tohumlama için iyi sonuç verir.
- 60 mm'lik bir OP50 plaka üzerinde yaklaşık 100-120 L1 evre larvayı tohumlamak için gereken larva kültürü hacmini aktarmak için bir mikropipet kullanın. Örneğin, yoğunluğu 10 L1 larva/1 μL kültür olan 10 μL'lik bir larva kültürünü tohumlayın.
not: Larvaları tohumlamak için 40 μL'lik bir hacmi aşmayın, aksi takdirde fazla sıvı OP50 çimini bozar. Kültür hacmi 40 μL'yi aşarsa, hacmi daha da azaltmak ve larva kültürünün yoğunluğunu artırmak için 2.3-2.4 adımlarını tekrarlayın.
- 24 °C'de solucan yetiştirin. L1'lerin plakaya ekildiği zamanı kaydedin ve diseksiyon için ideal zamanı belirlemek için gelişim aşamasını periyodik olarak kontrol edin.
not: L1'lerin tohumlanmasından 52 saat sonra, 24 ° C'de kültürlenen solucanlar tipik olarak gonad hedefli PLA için diseksiyon için ideal aşama olan genç yetişkin aşamasındadır. Bununla birlikte, senkronize solucanların genç yetişkin aşamasına ulaştığı gerçek zaman, suşlar ve kuluçka sıcaklığı arasında değişebilir.
3. Diseksiyon/gonad ekstrüzyonu
NOT: Gonad hedefli PLA'nın başarılı bir şekilde çalışması için gonadı ekstrüde etmek için diseksiyon gereklidir. Bu yaklaşım, PLA için bu protokolü kullanarak da çalışan embriyoları serbest bırakabilir (daha fazla bilgi için Tartışmaya bakınız). Diseksiyondan sonra, hem negatif kontrol hem de deneysel numuneler sabitlenir ve paralel olarak PLA için birlikte tedavi edilir. Ayrıca, ilgilenilen protein ortaklarının ekspresyon modellerini göstermek için floresan ko-immün boyama amacıyla ek bir numune setinin hazırlanması önerilmektedir.
- 30-40 genç yetişkin solucanı 500 μL 1x M9 + levamisol (2,5 mM nihai konsantrasyon) içeren bir saat camı kabına alın. Solucanları topladıktan sonra, solucanlarla birlikte aktarılan bakterileri uzaklaştırmak için ortamın çoğunu dikkatlice çıkarın ve atın.
- Taze 500 μL 1x M9 + levamisol ekleyin ve solucanları durulamak için ortamı nazikçe çekmek ve dağıtmak için pipeti kullanın. Solucanlarla birlikte aktarılan bakterileri temizlemek için ortamın çoğunu dikkatlice çıkarın ve atın.
- Tüm bakteriler temizlenene kadar bu adımı 2x-3x tekrarlayın. Yıkamalar tamamlandıktan sonra, nemli kalması için solucanları yaklaşık 100 μL ortamda bırakın.
not: Solucanların ortamda 7 dakikadan daha uzun süre kalmasına izin vermeyin, çünkü bu, diseksiyon sırasında gonadların ekstrüzyonunu bozacaktır. Solucanların kaybolmaması için ortamın çıkarılmasını izlemek için diseksiyon mikroskobu yardımıyla yıkama yapın.
- Bir cam veya polietilen pipet kullanarak, solucanları %0,001 poli-L-lizin ile kaplanmış 25 mm x 75 mm'lik bir mikroskop lamına aktarın (bu prosedürde kullanılan slaytlar, her biri 14 mm x 14 mm olmak üzere üç çalışma alanı bırakarak epoksi kaplı bir çevreye sahiptir). Fazla ortamı, yaklaşık 10-15 μL ortam kalacak şekilde çıkarın.
- Bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla ve iki adet 261/2 gauge iğne kullanarak, uçları bir makas oluşturacak şekilde bir iğneyi diğerinin üzerine yerleştirin. Bu şekilde yönlendirilmiş iğneleri kullanarak, germ hatlarını serbest bırakmak için farenksin arkasındaki solucanları kesin. Tüm solucanları 5 dakika içinde inceleyin.
not: Diseksiyonların nasıl yapılacağı hakkında daha fazla ayrıntı, Gervaise ve Arur tarafından hazırlanan önceki bir yayında bulunabilir.
- Tüm solucanlar disseke edildikten sonra, slayta dik olacak şekilde slaytın üzerine yavaşça 22 mm x 40 mm'lik bir lamel yerleştirin. Lamelin uçları slayttan sarkmalıdır.
- Slaytları en az 20 dakika kuru buz üzerinde tutulan önceden soğutulmuş bir alüminyum blok üzerinde dondurun. Buz genleşmesi nedeniyle lamelin gevşemesini önlemek için lamelin üzerine nazikçe soğutulmuş bir kalem yerleştirin.
4. Sabitleme/engelleme
- Sabitlemeye hazır olduğunuzda, lamelleri bir kurşun kalem veya başka bir keskin kenarlı aletle hafifçe vurun ve slaytı hemen 1 dakika boyunca taze, buz gibi soğuk metanol (-20 °C'ye soğutulmuş) içeren bir kavanoza daldırın.
- Numuneyi çevreleyen sürgünün kenarlarını nazikçe silin, böylece bir sonraki reaktif numunenin etrafındaki yüzey gerilimi ile tutulur. RT.
'de 5 dakika boyunca 150 μL fiksatif (100 mM KH2PO4, pH = 7.2'de% 2 formaldehit) uygulayın
not: Ayrıca bir metanol / aseton fiksasyon prosedürünü test ettik ve bunun PLA reaksiyonu ile uyumlu olduğunu bulduk.
- Sabitleyicinin slayttan akmasını ve kağıt havluya emmesini sağlamak için slaytı 90° dik bir açıyla bir kağıt havluya dokundurun. 50 mL 1x PBS /% 1 Triton X-100 /% 1 sığır serum albümini (PBT / BSA) içeren bir Coplin kavanozunda RT'de 15 dakika boyunca 2x slaytları engelleyin.
not: Bu engelleme adımı ve aşağıdaki bölüm 6-9'da yer alan yıkama adımları için Coplin kavanozları veya diğer boyama kavanozları önerilir. Bunlar, numune ile blokaj veya yıkama tamponunun verimli bir şekilde değiştirilmesi için yeterli hacimler sağlar.
- Slaytları %10 normal keçi serumu içeren bir PBT/BSA solüsyonu ile bloke edin. Slaytı çevreleyen kenarları nazikçe silin ve slayta 100 μL solüsyon uygulayın. Nemli bir odada RT'de 1 saat inkübe edin.
not: Bu adım, αFLAG primer antikoru ile boyama için şiddetle tavsiye edilir. Nemli oda, slaytların inkübe edilirken üzerine yerleştirilmesi için cam pipetlerin tepsiye bantla sabitlenmesiyle yapılır. Buharlaşmayı önlemek için tepsinin iç nemini yükseltmek için nemli görev mendilleri (Malzeme Tablosu) tepsiye yerleştirilir. Kapak ve tepsi, ışığa duyarlı adımlar sırasında numuneleri ışıktan korumak için folyo ile kaplanmıştır.
- PBT/BSA/%10 NGS solüsyonunun slayttan akmasını sağlamak için slaytı bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve slaytın kenarlarını nazikçe silin. Slaytları engellemek için engelleme reaktifini (Malzeme Tablosu) kullanın. 14 mm x 14 mm boşluğa bir damla uygulayın. Slaytları nemli bir odada 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
5. Birincil antikor inkübasyonu
>NOT: En iyi PLA sonuçlarını ve minimal arka planı elde etmek için, birincil antikorların seyreltme faktörünün optimizasyonu gerekebilir (daha fazla ayrıntı için Tartışmaya bakın). Ek olarak, birincil antikorlar, PLA için kullanılan ikincil antikorların özgüllüğüne uyan farklı konakçılarda yükseltilmelidir.
- Engelleme reaktifinin slayttan akmasına izin vermek için slaytı bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve kenarları nazikçe silin. Birincil antikorları seyreltmek için antikor seyrelticisini (Malzeme Tablosu) kullanın. 14 mm x 14 mm boşluk başına 40 μL primer antikor çözeltisi uygulayın.
- Slaytları nemli bir odada gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
6. PLA probu (ikincil antikor) inkübasyonu
NOT: 6-9. adımlar için RT'de A ve B yıkama arabelleklerini kullanın. Tamponlar 4 °C'de saklanıyorsa, kullanmadan önce RT'ye kadar ısınmalarını bekleyin.
- Bir Coplin kavanozunda RT'de 50 mL 1x yıkama tamponu A (Malzeme Tablosu) ile slaytları 2 kez 5 dakika yıkayın. Coplin kavanozunu 60 rpm'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya ayarlayın.
- Yıkama tamponunun slayttan akmasına izin vermek için slaytı bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve kenarlarını nazikçe silin. ARTI ve EKSİ probları içeren 40 μL'lik bir çözelti hazırlayın (antikor seyreltici ile 1: 5 oranında seyreltilmiş). Solüsyonu her 14 mm x 14 mm boşluğa uygulayın.
- Slaytları nemli bir odada 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
7. Ligasyon
- Bir Coplin kavanozunda RT'de 50 mL 1x yıkama tamponu A ile slaytları 2x 5 dakika boyunca yıkayın. Coplin kavanozunu 60 rpm'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya ayarlayın.
- Ligasyon tamponunu (Malzeme Tablosu) 1:5 oranında ultra saf su ile seyreltin. Çalışan bir ligasyon çözeltisi stoğu hazırlamak için liyazı (Malzeme Tablosu) 1:40 oranında seyreltmek için bu tamponu kullanın.
- Yıkama tamponunun slayttan akmasına izin vermek için slaytı bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve kenarlarını nazikçe silin. Her 14 mm x 14 mm boşluğa 40 μL ligasyon solüsyonu uygulayın.
- Slaytları nemli bir odada 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
8. Yükseltme
NOT: Kırmızı floroforlu algılama reaktiflerinin kullanılması (Malzeme Tablosu), C. elegans dokusunda en az miktarda arka plan ile sonuçlanır.
- Bir Coplin kavanozunda RT'de 50 mL 1x yıkama tamponu A ile slaytları 2x 5 dakika boyunca yıkayın. Coplin kavanozunu 60 rpm'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya ayarlayın.
- Amplifikasyon kırmızı tamponunu (Malzeme Tablosu) 1:5 oranında ultra saf su ile seyreltin. Çalışma amaçlı bir amplifikasyon çözeltisi stoğu hazırlamak ve ışıktan korumak için polimerazı (Malzeme Tablosu) 1:80 oranında seyreltmek için bu tamponu kullanın.
- Yıkama tamponunun slayttan akmasına izin vermek için slaytı bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve kenarlarını nazikçe silin. Her 14 mm x 14 mm boşluğa 40 μL amplifikasyon solüsyonu uygulayın.
- Slaytları nemli bir odada 37 ° C'de 1 saat ve 40 dakika inkübe edin. Numuneleri ışıktan korumak için nemli odanın folyo ile kapatıldığından emin olun.
9. Son yıkamalar
- Slaytları 2x 10 dakika boyunca 50 mL 1x yıkama tamponu B (Malzeme Tablosu) ile RT'de bir Coplin kavanozunda yıkayın. Coplin kavanozunu 60 rpm'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya ayarlayın.
- Bir Coplin kavanozunda RT'de 50 mL 0.01x yıkama tamponu B ile slaytları 1 dakika boyunca 1 kez yıkayın. Coplin kavanozunu 60 rpm'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya ayarlayın. Bu tampon, yıkama tamponu B'nin ultra saf su ile seyreltilmesiyle hazırlanır.
10. Lamel montajı
- Fazla yıkama tamponunun slayttan bir kağıt havlu üzerine akmasına izin verin ve sürgünün epoksi kaplı çevresinde kalan kalan tamponu silin.
- Örneklemek için 10 μL montaj ortamı (Malzeme Tablosu) ekleyin ve montaj ortamının yayılmasına izin verecek şekilde üstüne nazikçe bir lamel yerleştirin.
- Lameli kapatmak ve kaydırmak için lamel kenarını oje ile boyayın. Germ hatlarına zarar verecek olan lamel hareket etmesini önlemek için oje uygularken nazik olun. Mikroskop altında görüntülemeden önce slaytlar ışıktan korunurken ojenin RT'de en az 20 dakika sertleşmesine izin verin.
