Etkileşim çalışmaları için birlikte immünopresipite edilmiş proteinleri hazırlamak için zar üzerinde protein sindirimi

Özet

Kaynak: Obama, T. et al., Membran Üzerinde Sindirim Tekniği Kullanılarak Protein-Protein Etkileşimlerinin Değerlendirilmesi.J. Vis. Uzm.(2019)

Bu video, protein-protein etkileşim analizi için bir PVDF membranı üzerinde birlikte immünopresipite protein komplekslerini göstermektedir. Komplekslerden indirgenmiş proteinler, daha küçük peptitlerde tek tek proteinleri parçalamak için tripsin ile muamele edildi, daha sonra kalan peptitler PVDF zarından ekstrakte edildi. Kompleksteki her iki proteinden türetilen çekilen peptit daha sonra kurutuldu ve daha fazla analiz için düşük bir formik asit konsantrasyonunda yeniden süspanse edildi.

Protokol

1. İmmünopresipitasyon

NOT: Aşağıdaki bölümlerde açıklandığı gibi sodyum olmayan dodesil sülfat (SDS) lizis tamponu ve sitrat elüsyonu kullandık. Bununla birlikte, alternatif bir kurum içi immünopresipitasyon tekniğinin kullanılması, LC-MS/MS numunelerinin hazırlanması için de uygulanabilir olabilir.

1. Kültürlenmiş hücreleri, tek başına bir epitop etiketini veya bir füzyon proteinini kodlayan vektörlerle transfekte edin. Temsili veri elde etmek için, J774 hücrelerini (1 x 10⁶) tek başına yeşil bir floresan proteini (GFP) kodlayan vektörlerle veya katyonik lipozomlar kullanarak GFP ile kaynaşmış Capn6'yı....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Asetonitril	Wako (Vahşi)	014-00386
Sitrik asit	Wako (Vahşi)	030-05525
DTT (DTT)	Nacalai tesque	14112-94
Dynabeads proteini G	Thermo Fisher Bilimsel	10003D
Formik asit	Wako (Vahşi)	066-00461
İyodoasetamid	Wako (Vahşi)	095-02151
Lipofektamin 3000	Thermo Fisher Bilimsel	L3000008
Canlı Renkler A.v. Monoklonal Antikor (JL-8)	Clontech teknolojisi	632380
NaCl (Doğal)	Wako (Vahşi)	191-01665
NH4HCO3	Wako (Vahşi)	018-21742
Nonidet P-40	Sigma	N6507	Poli (oksietelen) oktilfenil eter (n = 9)
Proteaz inhibitörü kokteyli	Sigma	P8465 Serisi
Sıralama Sınıfı Modifiye Tripsin	Promega	V5111	Tripsin
Sodyum ortovanadat	Sigma	S6508 Serisi
Sodyum fosfat dibazik dihidrat	Sigma	71643
TFA (Radyo Frekansı	Wako (Vahşi)	206-10731
Tris	Wako (Vahşi)	207-06275
Ara-20	Wako (Vahşi)	160-21211

Serisi Fuar Serisi