1. İmmünopresipitasyon
NOT: Aşağıdaki bölümlerde açıklandığı gibi sodyum olmayan dodesil sülfat (SDS) lizis tamponu ve sitrat elüsyonu kullandık. Bununla birlikte, alternatif bir kurum içi immünopresipitasyon tekniğinin kullanılması, LC-MS/MS numunelerinin hazırlanması için de uygulanabilir olabilir.
- Kültürlenmiş hücreleri, tek başına bir epitop etiketini veya bir füzyon proteinini kodlayan vektörlerle transfekte edin. Temsili veri elde etmek için, J774 hücrelerini (1 x 106) tek başına yeşil bir floresan proteini (GFP) kodlayan vektörlerle veya katyonik lipozomlar kullanarak GFP ile kaynaşmış Capn6'yı (calpain-6 geni) aktarın.
- Manyetik boncuklara karşı konjuge antikor.
- Bu amaçla, anti-GFP antikorunu (2 μL/reaksiyon) manyetik boncuklarla (25 μL/reaksiyon) 500 μL sitrat fosfat tamponunda (24.5 mM sitrik asit, 51.7 mM dibazik sodyum fosfat; pH 5.0) 1.5 mL'lik bir test tüpünde karıştırın.
- Karışımı oda sıcaklığında 1 saat boyunca 50 rpm'de döndürün. Daha sonra, IgG konjuge boncukları% 0.1 Polioksietilen (20) sorbitan monolaurat içeren sitrat fosfat tamponu ile üç kez yıkayın.
- Transfekte edilmiş hücreleri uygun bir lizis tamponu kullanarak parçalayın. Temsili veriler elde etmek için, transfekte edilmiş hücreleri 400 μL lizis tamponunda (50 mM Tris-HCl; pH 7.5, 120 mM NaCl, %0.5 poli (oksietelen) oktilfenil eter) buz üzerinde 30 dakika boyunca parçalayın. 40 μmol / L fenilmetilsülfonil florür, 50 μg / mL leupeptin, 50 μg / mL aprotinin, 200 μmol / L sodyum ortovanadat, ve transfeksiyondan 24 saat sonra 1,5 mL test tüplerinde 1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA).
- 5 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüj ederek lizatı temizleyin ve süpernatanı toplayın.
- Lizatı önceden temizleyin. 1.5 mL'lik bir test tüpüne etiketlenmemiş manyetik boncuklar (25 μL / reaksiyon) ekleyin. Boncukları 500 μL sitrat fosfat tamponu ile üç kez yıkayın. Son yıkamada sitrat fosfat tamponunun çıkarılmasından sonra, hücre lizatını manyetik boncukların üzerine ekleyin. Karışımı, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 50 rpm'de bir döndürücü kullanarak döndürün.
- Test tüpünü manyetik ayırma için 5 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve hücre lizatını toplayın. Üretici tarafından belirlenen manyetik standın kullanılması tavsiye edilir.
- Hedef proteinleri konjuge boncuklara bağlayın. İmmünoglobulin (Ig) G konjuge boncukları manyetik ayırma için 5 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin, sitrat tamponunu atın ve ardından hücre lizatını ayrılan boncuklara ekleyin.
- Karışımı oda sıcaklığında 1 saat boyunca 50 rpm'de döndürün.
- Hedef proteinleri serbest hedef olmayan proteinlerden ayırın. Boncukları% 0.1 Polioksietilen (20) sorbitan monolaurat içeren 500 μL sitrat fosfat tamponu kullanarak üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 30 μL sitrat tamponu (pH 2-3) ekleyin ve hedef proteinleri elüte etmek için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
not: İmmünopresipitasyondan geri kazanım yetersizse, FLAG veya HIS gibi alternatif epitop etiketlerinin kullanılması verimliliği artırabilir. Elüsyonun verimliliği yetersizse, SDS bazlı bir çözelti gibi diğer elüantların kullanılması verimliliği artırabilir.
2. Proteinlerin zar üzerinde sindirimi
>NOT: Ekzojen proteinlerle kontaminasyonu önlemek için protein içermeyen malzeme ve ekipman kullanmak gereklidir. Ek olarak, insan proteinlerinin neden olduğu kontaminasyonu önlemek için operatörün cerrahi maske ve eldiven takması önerilir.
- PVDF membranları, kullanımdan hemen önce metanol ile silinmiş ve kurutulmuş cerrahi makas kullanarak 3 mm x 3 mm'lik parçalar halinde kesin.
- Temiz alüminyum folyo üzerindeki PVDF membran parçalarına 2-5 μL etanol ekleyin.
- Tamamen kurumadan önce, eluantı (her biri 2-5 μL, numune başına 4-6 parça) hidrofilik PVDF membranlarının üzerine ekleyin ve ardından membran yüzeyi mat hale gelene kadar membranları havayla kurutun. Kurutulmuş membranlar 4 °C'de saklanabilir.
- Tüm zarları 1,5 mL plastik tüplere aktarın, zarları hidrofilik hale getirmek için 20-30 μL etanol ekleyin ve ardından bir pipet kullanarak etanolü çıkarın.
- Membran tamamen kurumadan önce, 200 μL ditiyotreitol (DTT) bazlı reaksiyon çözeltisi (80 mM NH4HCO3, 10 mMDTT ve %20 asetonitril) ekleyin ve 56 °C'de 1 saat inkübe edin.
- Reaksiyon çözeltisini 300 μL iyodoasetamid çözeltisi (80 mM NH4HCO3, 55mM iyodoasetamid ve %20 asetonitril) ile değiştirin ve karanlıkta oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
- Membranları iki kez 1 mL damıtılmış su ile ve bir kez 1 mL %2 asetonitril ile girdap karıştırarak >10 saniye yıkayın.
- Liyofilize MS dereceli tripsini (Malzeme Tablosu) doğrudan reaksiyon çözeltisinde (% 70 asetonitril içeren 30 mM NH4HCO3) çözün. 1 μg tripsin (Malzeme Tablosu) (30 mM, NH4,HCO3, %70 asetonitril içeren 3) içeren reaksiyon çözeltisinden 100 μL ekleyin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- Triptik digestleri içeren reaksiyon solüsyonunu bir pipet kullanarak 1.5 mL'lik temiz bir test tüpüne aktarın.
- Membrana 100 μL yıkama solüsyonu (%70 asetonitril/%1 trifloroasetik asit) ekleyin ve 60 °C'de 2 saat inkübe edin. Yıkama solüsyonunu toplayın ve reaksiyon solüsyonu ile karıştırın. Membrana 100 μL daha yıkama solüsyonu ekleyin ve 10 dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra yıkama solüsyonunu toplayın ve reaksiyon solüsyonu ile karıştırın.
- Test tüpünü bir parça laboratuvar filmi ile örtün ve bir iğne ile birkaç küçük delik açın. Çözeltiyi bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun.
- Kalıntıyı 10 μL% 0.2 formik asit içinde çözün. Santrifüjlemeden sonra (12.000 × g, oda sıcaklığında 3 dakika), süpernatantı bir numune tüpüne aktarın.
not: Yıkamalar bu bölümün kritik adımlarıdır. Membran üstü protein sindirimi sırasında, indirgeme ve alkilasyondan sonra hareketsiz hale getirilmiş proteinleri içeren zarların damıtılmış su ile yıkanması, ardından %2 asetonitril ile her biri 10 saniyeden fazla süreyle yıkanması, reaktiflerin uzaklaştırılması için kritik öneme sahiptir.
