$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Biyosensör hidrasyonu ve tahlil kurulumu
- BLItz makinesini açın.
- Makinenin, makinenin arkasındaki bir USB veri çıkış bağlantı noktası aracılığıyla bilgisayara bağlı olduğundan emin olun.
- Bilgisayarda, ilgili yazılımı açın (örneğin, BLItz Pro) ve ekranın sol tarafındaki Gelişmiş Kinetik'e tıklayın.
- Yazılımda, deneyle ilgili tüm uygun bilgileri (Deney Adı, Açıklama, Numune Kimliği ve Protein Konsantrasyonu dahil) her bir başlığın altına yazın.
- Biyosensör Tipi'ne tıklayın ve açılır menüden Ni-NTA'yı seçin.
- Çalıştırma Ayarları başlığı altında, Shaker'ın Etkinleştir olarak ayarlandığını doğrulayın.
- Adım Türü Listesi başlığı altında, 5 öğenin listelendiğini doğrulayın: İlk Temel, Yükleme, Temel, İlişkilendirme ve Ayrışma.
not: Her adımın süresi gerektiği gibi varsayılandan değiştirilebilir. En iyi sonuçlar için, Başlangıç Taban Çizgisi ve Taban Çizgisi için en az 30 saniye kullanın; ve Birleşme ve Ayrışma için 120 s. Yükleme adımının süresi (120 ila 240 s arasında değişen), ligandın konsantrasyonuna ve ligand üzerindeki His-epitop etiketinin Ni-NTA-biyosensörüne afinitesine bağlı olacaktır.
- Hidratlı Ni-NTA biyosensörünü PCR tüpünden çıkarın ve biyosensörün geniş kısmını yuvanın üzerine kaydırarak makine üzerindeki biyosensör yuvasına yapıştırın.
not: Deney sırasında biyosensörün kurumasına izin vermeyin.
- Makinenin tüp tutucusuna 0,5 mL'lik bir siyah mikrosantrifüj tüpü yerleştirin ve içine 400μL BLI tamponu pipetleyin.
- Makinenin kaydırıcısının, boru tutucu makine üzerindeki siyah okun önünde yer alacak şekilde konumlandırıldığını doğrulayın.
- Makinenin kapağını, biyosensör ucu mikrosantrifüj tüpündeki tampona daldırılacak şekilde kapatın.
- İlk Taban Çizgisini kaydetmeye başlamak için yazılımda İleri'ye tıklayın.
2. Ligandın biyosensöre yüklenmesi
- İlk Taban Çizgisi adımı kayıt tamamlandıktan sonra, makinenin kapağını açın.
- Kaydırıcıyı, damla tutucu (tüp tutucu yerine) siyah okun önünde olacak şekilde sağa hareket ettirin.
- Diyalize girmiş His etiketli bir ligandı 4 μL'lik damla tutucuya pipetleyin ve makinenin kapağını kapatın.
NOT: Kullanılacak ligandın optimal konsantrasyonu her protein için değişebilir. 1.0 ila 2.0 mg / mL arasındaki bir konsantrasyon, biyosensörün ucundaki NTA'yı 240 s'de doyurmak için genellikle yeterlidir.
- Yazılımda, tıklayın Sonraki yüklemeye başlamak için.
3. Ek ligandın yıkanması
- Yükleme adımı kaydı tamamladıktan sonra, makinenin kapağını açın.
- Kaydırıcıyı, tüp tutucu bir kez daha siyah okun önüne gelecek şekilde sola hareket ettirin.
- Makinenin kapağını kapatın ve biyosensör ucunun tüp tutucudaki tüpün BLI tamponuna daldırıldığından emin olun.
- Temeli kaydetmeye başlamak için yazılımda bir kez daha İleri'ye tıklayın.
4. Analitin ligandla ilişkilendirilmesi
- Temel adımın kaydı tamamlandıktan sonra, makinenin kapağını açın.
- Damla tutucuyu çıkarın ve herhangi bir proteini pipetleyerek ve çift deiyonize su (ddH2O) ile toplam 5 kez durulayarak temizleyin.
- Yıkamadan sonra damla tutucunun yüzeyini temizlemek için bir mendil kullanın.
- Damla tutucuyu makineye geri takın.
- Makinedeki kaydırıcıyı, damla tutucu bir kez daha siyah okun önüne gelecek şekilde sağa doğru hareket ettirin.
- Damla tutucuya 4 μL diyalize alınmış bir analit pipetleyin ve makinenin kapağını kapatın.
- Yazılımda, İlişkilendirmeyi başlatmak için İleri'ye tıklayın.
5. Analitin liganddan ayrışması
- İlişkilendirme adımının kaydı tamamlandıktan sonra, makinenin kapağını açın.
- Makinedeki kaydırıcıyı, tüp tutucu bir kez daha siyah okun önüne gelecek şekilde sağa doğru hareket ettirin.
- Yazılımda, Ayrışmayı başlatmak için İleri'ye tıklayın.
- Ayrıştırma adımı kaydı bitirdikten sonra, makinenin kapağını açın.
- Damla tutucuyu ve tüp tutucuyu çıkarın.
- Herhangi bir proteini yıkamak için her ikisini de ddH2O ile iyice durulayın.
- Biyosensörü çıkarın ve güvenli bir şekilde atın.