$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Numune Hazırlama: Hücre-Hücre Karıştırma Testi
NOT: Aşağıdaki protokol, yapışık hücreler için karıştırma prosedürünü açıklamaktadır. Süspansiyon halinde kültürlenen hücreler için modifiye edilebilir.
- Transfeksiyondan bir gün önce 6 oyuklu bir plakaya, örneğin 800.000 HEK 293T hücresine (bir Neubauer sayma odası ile sayılır) uygun sayıda hücre tohumlayın. Sayı, tohumlama ve transfeksiyon arasındaki süreye bağlı olarak değiştirilebilir ve diğer hücre tipleri için ayarlanabilir. Temel bir deney yapmak için (yani, ilgilenilen proteinler ve negatif kontrol), en az 4 kuyu hazırlayın. 37 ° C'de kültür hücreleri,% 5 CO2 Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ortamında, fetal sığır serumu (% 10) ve L-glutamin (% 1) ile desteklenmiştir.
- Hücreleri üreticinin talimatlarına göre değiştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Temel bir deney yapmak için, 'yeşil' (örneğin, monomerik geliştirilmiş yeşil floresan proteini (mEGFP) veya sarı floresan proteini (mEYFP)) veya 'kırmızı' (örneğin, mCherry veya mCardinal) floresan proteinine kaynaşmış ilgilenilen protein için plazmitleri ayrı kuyucuklarda transfekte edin.
not: Bu protokolde, APLP1-mEYFP ve APLP1-mCardinal'e ve karşılık gelen negatif kontrole, örneğin miristoilenmiş-palmitoylalı-mEYFP (myr-palm-mEYFP) ve -mCardinal'e (myr-palm-mCardinal) odaklanıyoruz. Genellikle 200 ng - 1 μg plazmit DNA yeterlidir. Yüksek transfeksiyon verimliliği, temas halinde olan 'kırmızı' ve 'yeşil' hücreleri bulma şansını artırır. Transfeksiyon verimliliğini optimize etmek için plazmit ve transfeksiyon reaktifi miktarını değiştirin. Kritik: Hücreleri transfekte ederken hücre birleşmesi p civarında olmalıdır. Hücreler aşırı birleşikse, transfeksiyon verimliliği azalacaktır. Hücreler yeterince birleşmezse, transfeksiyon ve karıştırma strese neden olabilir ve birçok hücrenin karıştırıldıktan sonra uygun şekilde bağlanmasını önleyebilir.
- Transfeksiyondan ~ 4 ± 2 saat sonra hücre karıştırma işlemini gerçekleştirin.
- Büyüme ortamını çıkarın ve her birini Mg2 + ve Ca2 + ile takviye edilmiş 1 mL PBS ile nazikçe yıkayın. Ardından, PBS'yi çıkarın. (Kritik) Yıkama sırasında hücrelerin ayrılmasını önlemek için PBS'yi kuyu kenarına bırakın.
- Hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırmak için her bir oyuğa damla damla ~ 50 μL tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 2 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri ayırmak için 6 oyuklu plakayı yanal olarak yavaşça sallayın.
not: Bazı hücre tipleri için daha uzun kuluçka süreleri gerekebilir.
- Her bir oyuğa 950 μL büyüme ortamı ekleyin ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin, böylece tüm hücreleri kuyu dibinden ayırın. (Kritik) Yeniden süspansiyondan sonra büyük hücre agregalarının olup olmadığını görsel olarak kontrol ederek hücrelerin düzgün bir şekilde yeniden süspanse edildiğinden ve birbirinden ayrıldığından emin olun. Aksi takdirde, karıştırıldıktan sonra birçok 'kırmızı'-'kırmızı' veya 'yeşil'-'yeşil' temas elde edilecektir.
- Bir oyuğun hücre çözeltisini (ilgilenilen protein veya negatif kontrol) karşılık gelen kuyucuğa, yani 'kırmızı' (örneğin, APLP1-mKardinal transfekte edilmiş) ila 'yeşil' (örneğin, APLP1-mEYFP transfekte edilmiş) hücrelere aktarın. Yukarı ve aşağı birkaç kez hafifçe pipetleyerek karıştırın. Daha sonra, karışık hücreleri 35 mm'lik cam tabanlı tabaklara (tabak başına 1 mL karışık hücre çözeltisi, artı 1 mL büyüme ortamı) tohumlayın ve tohumlanmış hücreleri 37 ° C,% 5 CO2'de bir gün daha kültürleyin.
2. Numune hazırlama: çapraz korelasyon deneyleri için pozitif kontrol ve parlaklık analizi için homo-dimer yapısı
- 600.000 HEK 293T hücresini, hücre sayma haznesi ile sayılarak, transfeksiyondan bir gün önce 35 mm'lik cam tabanlı tabaklara tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de tam bir DMEM ortamında (bkz. adım 1.1) başka bir gün için kültürleyin.
- Üretici talimatlarına göre ~ 250 ng plazmit DNA ile hücreleri aktarın. Pozitif çapraz korelasyon kontrolü için, ilgilenilen proteinin FP'lerine karşılık gelen membrana bağlı bir floresan protein hetero-dimerini kodlayan bir plazmit kullanın, örneğin, myr-palmiye-mKiraz-mEGFP veya myr-palmiye-mKardinal-mEYFP. Parlaklık kalibrasyonu için, hem membrana bağlı bir FP monomerini hem de ilgilenilen proteine kaynaşmış FP'lere karşılık gelen homo-dimer'i kodlayan plazmitleri kullanın, örneğin, APLP1-mEYFP'nin parlaklık analizini kalibre etmek için myr-palmiye-mEYFP ve myr-palmiye-mEYFP-mEYFP.
- 37 ° C'de,% 5 CO2 tam DMEM ortamında başka bir gün için kültür hücreleri (bkz. adım 1.1).
3. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu: Kurulum ve Odak Hacmi Kalibrasyonu
NOT: Bu çalışmada kullanılan lazer taramalı konfokal mikroskopta mEGFP/mEYFP ve mCherry/mCardinal ile yapılan deneyler için aşağıdaki protokol yazılmıştır. Optik kurulum, yazılım ayarları (lazer çizgileri, dikroik aynalar, filtreler) ve kalibrasyon boyalarının seçimi diğer FP'ler ve mikroskop kurulumları için değiştirilebilir.
- Lazer stabilitesini ve sıcaklığın dengelenmesini sağlamak için deneyden en az bir saat önce mikroskobu ve lazerleri açın.
- Odak hacmini kalibre etmek için 10-50 nM aralığındaki konsantrasyonlarla su veya PBS'de 100-200 μL uygun suda çözünür floresan boya çözeltileri (örnekler için Malzeme Tablosuna bakın) hazırlayın.
- Boya çözeltilerini 35 mm'lik temiz bir cam alt tabak #1.5, yani 0.16-0.19 mm kalınlığa sahip
not: İdeal olarak, düşük kalınlık toleransına sahip, örneğin 0,170 ± 0,005 mm olan ve optimum yaka halkası düzeltmesine izin veren yüksek performanslı kapak camına sahip tabaklar kullanın (adım 3.6). Aşağıdaki deneyler için daha sonra kullanılanla aynı tür yemeğin kullanılması önemlidir.
- Çözeltiye odaklanmayı sağlamak için boya çözeltisini içeren kabı doğrudan objektifin üzerine yerleştirin (tercihen suya daldırma, NA 1.2 ile). Alternatif olarak, tabağı numune tutucuya yerleştirin ve numuneye odaklanın (örneğin, tabağın tabanının 10-20 μm üzerinde).
NOT: Sulu numunelerin derinliklerine odaklanırken elde edilen zayıf sinyal nedeniyle yağ hedeflerinin kullanılmasını önermiyoruz.
- Uyarma ve emisyon yolunu ayarlayın, örneğin 488 nm lazer, 488/561 nm dikroik ayna, algılama penceresi 499-552 nm ve 1 Airy birimi (AU) iğne deliği boyutunu seçin. İğne deliği boyutunun, çapraz korelasyon ölçümlerinde kullanılacak olanla aynı olduğundan emin olun.
- Sayım oranını en üst düzeye çıkarmak için iğne deliği konumunu (iğne deliği ayarı) ve objektif bileziği halkasını ayarlayın. Bunun için yaka halkasını maksimum sayım hızı tespit edilene kadar çevirin.
not: Yaka halkası düzeltmesi, kullanılan kapak camının belirli kalınlığını hesaba katar. Sayım oranını en üst düzeye çıkarmak, yani molekül başına mümkün olduğunca çok foton toplamak, ölçümlerin sinyal-gürültü oranını (SNR) en üst düzeye çıkarmak için çok önemlidir.
- Çapraz korelasyon ölçümlerinde kullanılanla aynı lazer gücünde (tipik olarak ~%1, yani ~1-2 μW) bir dizi nokta FCS ölçümü (örneğin, farklı konumlarda 6 ölçüm, her biri 10 s'lik 15 tekrardan oluşur, yani 2,5 dakikalık toplam süre, 1 μs veya daha az bekleme süresi ile örneklenir) gerçekleştirin.
- Verilere üçlü katkı (Denklem 1) içeren üç boyutlu bir difüzyon modeli sığdırın.
not: Tipik olarak, elde edilen difüzyon süreleri 30 μs civarındadır ve yapı faktörü 4-8 civarındadır.
- Denklem 2.
>'ye göre kullanılan boyanın oda sıcaklığında difüzyon katsayısı için ölçülen ortalama difüzyon süresinden ve yayınlanan değerlerden bel w 0'ı hesaplayın
Tipik değerler 200-250 nm'dir.
- Gerekirse ikinci bir algılama kanalı için kalibrasyon rutinini (adım 3.4-3.9) farklı bir floresan boya ile tekrarlayın (örneğin, 561 nm uyarma ve 570 nm ile 695 nm arasında algılama). İğne deliği konumunu ve boyutunu ilk algılama kanalı için ayarlandığı gibi tutun.
- Kalibrasyon ölçümlerinden moleküler parlaklığı (Denklem 3) hesaplayın ve elde edilen değerleri saklayın.
not: Kullanılan kurulum için tipik değerler, 1,8 μW 488 nm uyarma gücü için ~8-10 kHz/molekül/moleküldür (MOL). Normalden daha düşük değerler, objektif üzerindeki kiri, kurulumun yanlış hizalandığını veya lazer çıkışının azaldığını gösterebilir. Bir güç ölçer kullanarak objektifteki lazer çıkış güçlerini düzenli olarak kontrol edin ve saklayın. Farklı kurulumların karşılaştırılması için, uyarma lazer gücü ile normalleştirilen moleküler parlaklık, mikroskop performansını değerlendirmek için en anlamlı parametredir.
4. Taramalı Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi: Edinme
>NOT: Bu çalışmada kullanılan lazer taramalı konfokal mikroskopta mEGFP/mEYFP ('yeşil') ve mCherry/mCardinal ('kırmızı') ile yapılan deneyler için aşağıdaki protokol yazılmıştır. Optik kurulum ve yazılım ayarları (lazer çizgileri, dikroik aynalar, filtreler) diğer FP'ler veya mikroskop kurulumları için farklı olabilir.
- Optik yolu ayarlayın, örneğin 488 nm ve 561 nm uyarma ve 488/561 nm dikroik ayna, 1 nm uyarma için 488 AU'da iğne deliği. Spektral karışmayı önlemek için, mEGFP/mEYFP (488 nm uyarma, yeşil kanal) ve mCherry/mCardinal (561 nm uyarma, kırmızı kanal) sırayla uyarmak ve algılamak için iki ayrı kanal seçin ve her satırda anahtar izleri seçin. Algılama için her iki kanal için de uygun filtreler kullanın, örneğin yeşil kanalda 499-552 nm ve kırmızı kanalda 570-695 nm.
- Alternatif uyarma mümkün değilse, spektral karışmayı en aza indirmek için kırmızı kanal için uygun filtre ayarlarını kullanın (yani, 600 nm'nin altında olmayan mCherry / mCardinal floresansını tespit edin). Bu, kırmızı kanalda tespit edilen foton miktarını azaltabilir ve böylece SNR'yi azaltabilir.
- Karışık hücreleri içeren tabağı numune tutucuya yerleştirin. Sıcaklık dengesini sağlamak ve odak kaymasını azaltmak için en az 10 dakika bekleyin.
- Bul menüsündeki iletim ışığını kullanarak hücrelere odaklanın.
- Birbiriyle temas halinde olan bir çift 'kırmızı' ve 'yeşil' hücre arayın. Pozitif çapraz korelasyon veya homo-dimer parlaklık kontrolü için (bkz. bölüm 2), her iki kanalda da floresan yayan izole bir hücre veya PM.
'da ilgili homo-dimer sinyalini arayın
NOT: (Kritik) Ön ağartmayı önlemek için hücre ararken numune maruziyetini en aza indirin, bu da çapraz korelasyonu azaltabilir. Bu nedenle, en yüksek tarama hızında ve düşük lazer güçleriyle tarayın. Güçlü bir şekilde ifade eden hücreleri görüntülerken dedektör doygunluğunu önlemek için entegrasyon modunda arama yapın. Bununla birlikte, maruziyeti en aza indirmek için, foton sayma modunda daha düşük lazer güçlerinde tarama yapmak mümkündür.
- Şekil 1B ve 2A'da gösterildiği gibi Kırp düğmesini kullanarak hücre-hücre temasına (veya pozitif çapraz korelasyon veya homo-dimer parlaklık kontrolü için tek bir hücrenin PM'sine) dik bir tarama yolu seçin.
not: Bazı eski mikroskoplar rastgele tarama talimatlarına izin vermez. Bu durumda, tarama yönüne dik bir oryantasyona sahip hücre-hücre kontakları yerleştirilmelidir.
- 50-200 nm'lik bir piksel boyutu elde etmek için yakınlaştırın ve Tarama Modunda Çizgi'yi seçin. Çerçeve Boyutu'nu 128 × 1 piksel olarak ayarlayın.
not: Tipik piksel boyutu 160 nm'dir ve yaklaşık 20 μm'lik bir tarama uzunluğuna karşılık gelir.
- Tarama hızını izin verilen maksimum değere ayarlayın, örneğin satır başına 472,73 μs.
not: Alternatif bir uyarma şeması için bu, 954.45 μs tarama süresine, yani kullanılan kurulumda ~1000 tarama/s'ye karşılık gelir. Tarama hızı, ilgilenilen proteinin difüzyon katsayısına bağlı olarak ayarlanabilir. Membrana bağlı proteinler için tipik difüzyon süreleri yaklaşık 10-20 ms'dir. Tarama süresi, difüzyon sürelerinden en az on kat daha küçük olmalıdır. Daha düşük tarama hızları, daha güçlü foto ağartmaya neden olabilir ve daha düşük aydınlatma güçleri gerektirebilir. Alternatif olarak, Zaman Serisi alt menüsündeki Aralık kullanılarak çok yavaş yayılan kompleksler için her tarama arasında 5 ms'lik bir duraklama uygulanabilir.
- Uygun lazer güçlerini seçin, örneğin, 488 nm için ~1-2 μW ve 561 nm uyarma için ~5-10 μW.
not: Daha yüksek lazer güçleri SNR'yi iyileştirir, ancak fotobleaching'i artırır. Bu nedenle, lazer güçleri, foto ağartma ilk sayım oranının P'sinden daha az olacak şekilde seçilmelidir.
- Döngüleri 100.000-500.000.
olarak ayarlayın
not: Tarama sayısı, yani ölçümün süresi değişebilir: Daha uzun ölçüm süreleri SNR'yi iyileştirecektir ve yavaş yayılan moleküller için daha uygun olabilir, ancak hücrelerin hareketi ve foto ağartma maksimum ölçüm süresini sınırlar. Burada sunulan veriler rutin olarak ~ 3-6 dakika, yani 200.000-400.000 satır taraması için elde edildi.
- Dedektörleri Foton sayma moduna ayarlayın. Satın almayı başlatmak için Denemeyi Başlat'a basın. Başka bir hücreyi ölçmek için 4.5-4.11 adımlarını tekrarlayın.
not: Farklı ekspresyon seviyelerinde numune başına 10-15 hücrenin ölçülmesi önerilir. (Kritik) Yüksek ifade seviyelerinde dedektör doygunluğundan kaçının. Maksimum sayım hızı ~1 MHz'i geçmemelidir.
- Oligomerik durumları belirlemek için parlaklık analizi yapılırsa, değiştirilmiş 4.1-4.11 adımlarına göre homo-dimer parlaklık kalibrasyon ölçümleri yapın: Her bir floresan protein homo-dimerini ayrı ayrı ölçün (protokol bölüm 2 kullanılarak hazırlanan izole hücrelerde) ve ölçümleri yalnızca bir spektral kanalda gerçekleştirin.
