Transfekte Edilmiş Hücrelerde Enzim Reseptör Etkileşimlerini İncelemek için İmmünopresipitasyon Testi

Özet

Kaynak: Strazza, M., et al. Reseptörler ve enzimler arasındaki fonksiyonel etkileşimleri incelemek için ko-immünopresipitasyon testi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, anti-GFP antikorları ile kaplanmış boncuklar kullanarak GFP etiketli vahşi tip ve mutasyona uğramış PD-1 proteinlerinin ko-immünopresipitasyonunu gerçekleştirmek için bir teknik gösteriyoruz. Boncuk bağlı PD-1-GFP proteinleri, PD-1 ile etkileşime giren SHP2 proteinleri ile inkübe edilir ve PD-1'de SHP2 etkileşiminde kritik bir rol oynayan spesifik yapısal motiflerin tanımlanmasını sağlar.

Protokol

1. İmmünopresipitasyon

NOT: Aşağıdaki adımlar buz üzerinde veya 4 °C'de gerçekleştirilmelidir.

1. Lizis tamponunu (pH 7.2'de 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, %0.1 NP-40, 2 mM EDTA, %10 gliserol) proteaz inhibitörleri (10 mL lizis tamponunda 1 tableti çözün) ve 1 mM sodyum ortovanadat ile takviye edin. Hücrelere 500 μL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin ve bir hücre sıyırıcı kullanarak hücreleri hemen plakalardan çıkarın ve toplayın.
   not: Sodyum ortovanadatın sadece PD-1-GFP ile transfekte edilmiş plakalar için kullanılacak lizis tamponuna eklenmesi önemlidir, çünkü SHP2 ile transfekte edilmiş plakalar ve transfekte edilmemiş kontrol plakaları fosfataz aktivitesini korumalıdır.
2. Lizatları 1,5 mL'lik soğuk tüplere aktarın ve 0,005 x g, 4 °C'de 30 dakika döndürün.
3. Lizatlardan post çekirdek süpernatantını (PNS) toplamak için, lizatları 4 ° C'de 10.000 x g'de 10 dakika boyunca döndürün ve süpernatanları yeni tüplere aktarın. Peleti atın. İkinci altı plaka setinin (Şekil 1) süpernatantlarını daha sonra tam hücre lizat analizi için buz üzerinde saklayın.
4. İlk setin (dört plaka) PD-1-GFP ile transfekte edilmiş lizatlarından PD-1-GFP'nin immünopresipitasyonu için anti-GFP boncuklarının hazırlanması (Şekil 1).
   1. Boncukların çökelmesini önlemek için, açmadan önce şişeyi boncuklarla hafifçe sallayın. Her koşul için bulamaçtan 40 μL anti-GFP boncukları çıkarın.
   2. 4 °C'de 3 dakika boyunca 500 x g'da döndürün ve boncukları yıkamak için süpernatanı çıkarın.
      not: Kaybı önlemek için pipet plastik uçları ile agaroz boncukları arasındaki teması en aza indirmek önemlidir. Boncukları başka bir tüpe aktarmadan önce 200 μL'lik bir ucun kenarının kesilmesi önerilir.
   3. Boncukları 80 μL lizis tamponunda (numune başına) yeniden süspanse edin.
5. Yıkanmış boncukları, ilk setin (dört plaka) PD-1-GFP eksprese eden hücrelerinden doğrudan hücre lizatına (PNS) ekleyin (adım 1.3). GFP etiketli proteinleri immünopresipite etmek için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 0.005 x g'da döndürün.
6. Boncukları 1 mL soğuk lizis tamponu (ortovanadat olmadan) ile 3 kez yıkayın. Tüpü 10 s.
   için 2.500 x g'da santrifüjleyin not: Lizis tamponunu boncuklara eklerken, uçlarla dokunmadan doğrudan boncukların üzerine ekleyin. Yıkamalar sırasında yukarı ve aşağı pipetlemeye gerek yoktur.
7. Aynı şekilde, aktif SHP2'nin lizatını ilk setten (bir plaka; adım 1.3) bölün ve yıkanmış PD-1-GFP içeren boncukların üç tüpüne ekleyin (WT PD-1-GFP ve iki farklı fosfo eksikliği olan mutasyon, Y223F ve Y248F). Transfekte edilmemiş hücrelerin lizatından hacmin üçte birini WT PD-1-GFP boncuklarının ikinci tüpüne ekleyin. Kalan üçte ikisini atın.
8. Boncukları hafif dönüşle (0,005 x g) 4 ° C'de 4 saat inkübe edin.
9. Boncukları, adım 1.6'da bildirildiği gibi 1 mL soğuk lizis tamponu (pervanadat veya ortovanadat olmadan) ile iki kez yıkayın.
10. Her tüpteki toplam hacmin 100 μL (20 μL boncuk ve 80 μL lizis tamponu) olduğundan emin olarak numune başına 80 μL lizis tamponu (pervanadat veya ortovanadat olmadan) ekleyin. Nazikçe karıştırın ve her tüpten 50 μL'yi iki taze 1,5 mL tüpe aktarın.
    not: Bu adımı takiben, boncuklar ve lizis tamponu içeren bir karışımla doldurulmuş iki tüp olacaktır. Tüplerden biri, ko-immünopresipite edilmiş SHP2'yi western blotlama ile test etmek için kullanılacaktır.

2. SHP2 Batı Lekesi Analizi

1. Boncukları aşağı doğru döndürün ve süpernatanı çıkarın.
2. Boncuklara 20 μL 2x Laemmli tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 95 °C'de 5 dakika kaynatın.
3. Bir BCA kiti kullanarak giriş kontrollerinin (ikinci set) protein konsantrasyonunu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız). En seyreltilmiş numunenin 30 μL'sini yeni bir tüpe aktarın. Giriş kontrollerinin geri kalanını lizis tamponu ile en çok seyreltilmiş numune ile aynı konsantrasyona seyreltin ve her birinden 30 μL'yi yeni bir tüpe aktarın.
   not: Bu adımı takiben, her biri 30 μL'lik 4 tüp, benzer protein konsantrasyonlarında, giriş kontrolleri lizatlarını temsil eder.
4. Lizatlara eşit hacimlerde 2x Laemmli tamponu ekleyin ve 95 °C'de 5 dakika kaynatın. Boncukları aşağı doğru döndürün ve süpernatanı batı lekesi analizi için %4-20 SDS-PAGE Tris bazlı jel (Malzeme Tablosuna bakınız) üzerine yükleyin. Ek olarak, ikinci setin her bir örneğinden 50 μL yükleyin.
5. Western blot analizi ile devam edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Deneysel koşullar ve strateji. GFP-PD-1 WT (vahşi tip), GFP-PD-1 Y223F (ITIM mutant) veya GFP-PD-1 Y248F (ITSM mutant), daha sonra pervanadat ile muamele edilen HEK 293T hücrelerinde eksprese edildi. GFP immünopresipitasyonu ile toplanan fosforile GFP-PD-1 proteinleri, SHP2'yi aşırı eksprese eden hücrelerden lizatlarla karıştırıldı ve PD-1'in her bir versiyonuna bağlı SHP2'nin seviyeleri ve...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Nitroselüloz membranlar	General Electric (Türkçe)	10600004
Mikrosantrifüj	Eppendorf Belediyesi	5424-R	1,5 mL
BCA (Mali İşler T	balıkçı	23225	Bi Sinchoninic Asit testi
Anti-SHP2	Santa Cruz Plajı	SC-280 Serisi
Anti-GFP-agaroz	MBL (MBL)	D153-8
GFP Karşıtı	Roche	118144600
Anti-Aktin	Santa Cruz Plajı	SC-1616
HEK-293 hücreleri	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-1573
Ortovanadat	Sigma	S6508 Serisi
Proteaz inhibitörü kokteyli	Roche	11836170001	EDTA içermez
Tris-Glisin SDS Numune Tamponu (2x)	Canlandırıcı	LC2676	Modifiye Laemmli tamponu
%4-20 Tris-Glisin Mini Jeller	Canlandırıcı	XP04205BOX	15 kuyulu
Tripsin-EDTA (% 0.25) Fenol Kırmızısı	Gibco (Gibco)	25200114
NaCl (Doğal)	Sigma	S7653 Serisi	Sodyum klorür

Serisi Serisi Serisi Serisi