Yem ve Av Proteinleri Arasındaki Etkileşimleri Analiz Etmek için ELISA Tabanlı Yöntem

Abstract

Kaynak: Singh, B. ve ark., Vitronektinin Bakteriyel Yapışma ve Serum Direncindeki Rolünü İncelemek İçin Deneyler. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, ikinci proteinin hareketsiz hale getirilmiş birinci proteine bağlanmasını ölçerek iki protein arasındaki protein-protein etkileşimlerini tespit eden ELISA tabanlı bir teknik açıklanmaktadır. Bağlı ikinci protein, yaban turpu peroksidaz gibi bir enzim ile etiketlenmiş spesifik antikorlar kullanılarak tespit edilir.

Protocol

1. Rekombinant PH ve Vn arasındaki etkileşimin ELISA analizi

NOT: Belirli olmayan bağlamayı dışlamak için denetimlerin dahil edilmesi gerekir. İnsan Faktörü H (FH) veya C4b bağlayıcı protein (C4BP) sırasıyla pozitif ve negatif kontrol olarak kullanılır.

1. İnsan proteinlerinin her birini (Vn, FH ve C4BP) ayrı ayrı Tris-HCl, pH 9.0'da (kaplama tamponu) 50 nM'ye seyreltin. Bir Polisorp mikrotitre plakasının her bir oyuğuna 100 μL protein çözeltisi dağıtın. Plakaları kapakla kapatın ve proteinin mikrotitre plaka kuyucuklarına immobilizasyonunu kolaylaştırmak için gece boyunca (16 saat) 4 ° C'de saklayın.
2. Çözeltiyi mikrotitre plakasından lavabonun üzerine baş aşağı eğerek atın ve kuyucukları 300 μL PBS / kuyu ile üç kez yıkayın. Kaplanmış kuyucukları RT'de 1 saat boyunca% 2,5 (a / h) BSA (PBS-BSA) içeren PBS ile bloke edin.
3. Blokaj solüsyonunu çıkardıktan sonra, kuyucukları kuyucuk başına% 0.05 (h / h) Tween 20 (PBST) içeren 300 μL PBS ile üç kez yıkayın. Her numune kuyucuğuna 100 μL 50 nM rekombinant His etiketli PH ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin. Kontrol kuyucuklarına sadece 100 μL PBS-BSA.
   ekleyin not: Hif'ten PH'ı kodlayan lph geni, PCR ile amplifiye edildi ve eksprese edilen proteinin C-terminalinde 6× His etiketi ekleyen pET26b ekspresyon vektörüne klonlandı. Rekombinant vektör, ekspresyon için E. coli BL21 (DE3)'e dönüştürüldü. Rekombinant proteini saflaştırmak için Ni-NTA reçinesi kullanıldı.
4. Protein çözeltisini atın ve kuyucukları kuyu başına 300 μL PBST ile üç kez yıkayarak bağlanmamış proteinleri çıkarın. Yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge anti-His pAbs (1: 10.000 seyreltme) içeren 100 μL PBS-BSA ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin.
5. Tetrametilbenzidini %5 aseton ve %45 metanol çözeltisi içinde çözerek 20 mM çözelti A hazırlayın. B çözeltisini hazırlamak için, 19.2 g sitrik asidi 1.000 mL H₂O içinde çözün, KOH ekleyerek pH'ı 4.25'e ayarlayın, ardından 230 μL% 30 H₂O₂ ekleyin. Her iki çözümü de karanlıkta RT'de saklayın. Kullanmadan hemen önce, ELISA tespit reaktifini hazırlamak için 500 μL çözelti B'yi 9.5 mL çözelti A ile karıştırın.
6. Kuyucukları kuyu başına 300 μL PBST ile üç kez yıkayın ve her oyuğa 100 μL ELISA tespit reaktifi ekleyerek antijen-antikor komplekslerini tespit edin.
7. Reaksiyonu durdurmak için 50 μL 1 M H_2S4 / kuyu ekleyin. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak kuyuların optik yoğunluğunu 450 nm'de ölçün.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AR2G sensörleri	Pall Yaşam Bilimleri	18-5095	Amino birleştirme ile hareketsiz hale getirilmiş proteine sensör
aseton	VWR (VWR)	97064-786	Analiz notu
Sığır Serum Albüminleri (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Hücre kültürü için uygun
C4BP (C4b bağlayıcı protein)	Tamamlayıcı Teknoloji, Inc.	A109	Dondurulmuş sıvı form olarak satın alınır
Sitrik asit	Sigma-Aldrich	251275-500G	Amerikan Kimya Derneği (ACS) notu
HRP konjuge anti-His tag antikorları	Abcam Belediyesi	AB1269	Poliklonal
C4BP	Tamamlayıcı Teknoloji, Inc.	A109	Dondurulmuş çözelti
Histidin afinite reçine sütunu (HisTrap HP)	GE Health Care Yaşam Bilimleri	17-5247-01	Ni Sepharose ile önceden paketlenmiş sütunlar
Onun etiketli PH'ı			Laboratuvarımızda rekombinant olarak eksprese edilir ve saflaştırılır
Methano Belediyesi	VWR (VWR)	BDH1135-1LP	Analiz notu
Omurga üzerinde C-terminal 6x His-tag içeren plazmit (pET26(b))	Yenilikçi	69862-3 (İngilizce	DNA vektörü
Polisorb mikrotitre plakaları	Sigma-Aldrich	M9410	ELISA için
Tetrametilbenzidin	Sigma-Aldrich	860336-100 MG	ELISA sınıfı
İnsan plazmasından vitronektin (Vn)	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Hücre kültürü sınıfı