Protein-Protein Etkileşimleri için β-Laktamaz Tabanlı Kondüktimetrik Biyosensör Testi

Özet

Kaynak: Vandevenne, M., et al. Biyomoleküler Etkileşimleri Tespit Etmek için β-Laktamaz Tabanlı İletken Biyosensör Testinin Kullanımı. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, bir antikorun bir dönüştürücü çip üzerinde hareketsiz hale getirilmiş bir hedef antijen ile etkileşimini incelemek için iletken bir biyosensör testini göstermektedir. Biyosensör, iki işlevli bir kimerik proteine sahip olacak şekilde tasarlanmıştır - hareketsizleştirilmiş hedef antijene bağlanmak için bir nano gövdeye kaynaşmış fonksiyonel bir katalitik bölgeye sahip bir β-laktamaz enzimi. Bağlanma üzerine, bir antibiyotik substratının β-laktamaz enzimi tarafından katalitik hidrolizi, antijen-antikor etkileşimini doğrulayan bir elektrik sinyali üretir.

Protokol

1. Protein Örneği Hazırlama

1. Önceki çalışmamızda bildirildiği gibi hibrit protein BlaP-cAb-Lys3'ü üretin ve saflaştırın. Proteini aşağıdaki bileşimle 50 mM fosfat tampon pH 7.4'te saklayın: 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na₂HPO₄ ve 0.24 g KH₂PO₄ 800 mL damıtılmış su içinde çözülmüş Çözeltinin son hacmini 1 L'ye ayarlamadan önce çözeltinin pH'ını 7.4'e sabitleyin. Filtre protein çözeltisini sterilize eder.
2. Bir tavuk yumurtası akı lizozim (HEWL) stok çözeltisi hazırlayın. Ticari olarak satın alınan 100 mg (40.000 birim / mg) HEWL'yi 10 mL fosfat tampon salin içinde çözün (PBS bkz. adım 2.1.1). Protein çözeltisini, 0.22 μm'lik bir kesime sahip filtreler kullanarak filtreleyerek sterilize edin.

2. Biyosensör Testleri

1. Çözelti ve tampon hazırlama
   1. 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g_Na2HPO4ve 0.24 g KH₂PO_4'ü 800 mL damıtılmış suda çözerek 50 mM PBS hazırlayın. Çözeltinin hacmini 1 L'ye ayarlamadan önce 1 N HCl veya 1 N NaOH ile pH 7.4'e ayarlayın. Filtreyle sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın.
   2. Yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan 100 mL PBS içinde 3 g kazein hidrolizatını çözerek bir doygunluk/bloke edici çözelti hazırlayın (bkz. adım 2.1.1). Süzün, sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
   3. Yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan 100 mL PBS içinde 1 g kazein hidrolizatını çözerek bir bağlayıcı çözelti hazırlayın (bkz. adım 2.1.1). Süzün, sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
   4. Yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan 100 mL PBS'ye 100 μL Tween 20 (%100) ekleyerek bir yıkama solüsyonu (%0.1 Tween - PBS) hazırlayın (bkz. adım 2.1.1). 4 °C'de saklayın.
   5. Yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan 100 mL PBS'ye 1 mL Triton X-100 (%100) ekleyerek bir elektrot hazırlama solüsyonu (%1 Triton X-100 - PBS) hazırlayın (bkz. adım 2.1.1). 4 °C'de saklayın.
   6. 26 g KCl'yi damıtılmış suda 100 mL'lik bir nihai hacme çözerek bir elektrot rejenerasyon çözeltisi (3,5 M KCl) hazırlayın. Filtre, sterilize edilmiş ve 4 °C'de saklayın.
   7. 0.29 g NaCl'yi damıtılmış suda 1 L'lik son hacme kadar çözerek 5 mM'lik bir NaCl çözeltisi hazırlayın. Filtre, sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın. Daha sonra, 26.7 mg benzilpenisilini 20 mL 5 mM NaCl çözeltisi içinde çözerek bir tespit çözeltisi (4 mM benzilpenisilin) hazırlayın. Filtre, sterilize edin ve -20 °C'de saklayın.
2. Sensör hazırlama ve rejenerasyon
   not: Polianilin kaplı sensör çipleri, Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus ve Prof. Y. Glupczynski'nin (Louvain-la-Neuve Katolik Üniversitesi - CHU Mont-Godinne) tarafından geliştirilmiş ve sağlanmıştır. Sensörün tanımı ve bu sensörleri sentezlemek için kullanılan polianilin elektro-polimerizasyon protokolleri önceki çalışmalarında detaylandırılmıştır. Kısaca bu sistem, klasik baskılı devre kartı (PCB) teknikleriyle üretilmiş sekiz ayrı çipin yeniden kullanılabilir sensörlerini kullanır. Bireysel çipler üç elektrot yuvarlak noktasından oluşur. En üstteki, polianilinin elektro-sentezlendiği çalışma elektrotudur. Ortadaki referans elektrottur ve alttaki elektrot karşı elektrotu oluşturur. Hem referans hem de karşı elektrotlar, karbon tabakasının üstünde katı Ag / AgCl amalgamı kullanılarak işlevselleştirilir.
   1. Uçları 300 μL/kuyucuk elektrot hazırlama solüsyonu (% 1 Triton X-100 - PBS, bkz. adım 2.1.5.) içeren 96 oyuklu bir plakanın kuyularına daldırarak elektrotları 3 yıkama gerçekleştirin. Her yıkamayı oda sıcaklığında nazikçe karıştırarak 2 dakika boyunca gerçekleştirin.
   2. Elektrotları, uçları 300 μL/kuyu damıtılmış su içeren 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 2 dakika boyunca oda sıcaklığında hafifçe karıştırarak durulayın.
   3. Elektrotları, uçları 300 μL/kuyucuk rejenerasyon çözeltisi (3,5 M KCl, bkz. adım 2.1.6) içeren 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına daldırarak gece boyunca 4 °C'de veya oda sıcaklığında 1 saat rejenere edin.
   4. Uçları 300 μL/kuyucuk fosfat tampon salin içeren 96 oyuklu bir plakanın kuyularına daldırarak elektrotları 3 kez yıkayın (bkz. adım 2.1.1.). Her yıkamayı oda sıcaklığında nazikçe karıştırarak 2 dakika boyunca gerçekleştirin.
3. Sensör üzerinde gerçekleştirilen bağlama testi
   1. PBS'de hazırlanan 40 μg/mL HEWL'yi elektrot yüzeyine 15 μL'lik bir damla bırakarak HEWL'yi elektrotun PANI (polianilin) yüzeyine kaplayın. Gece boyunca 4 °C'de veya oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   2. Sensör çiplerinin elektrot parçalarını 300 μL/kuyucuk fosfat tampon salin içeren 96 oyuklu bir plakanın kuyularına daldırarak elektrotları fosfat tampon salin ile üç kez yıkayın (bkz. adım 2.1.1). Her yıkamayı oda sıcaklığında nazikçe karıştırarak 2 dakika boyunca gerçekleştirin.
   3. Elektrot yüzeyine 50 μL'lik bir damla blokaj solüsyonu (bkz. adım 2.1.2) ekleyerek elektrotları doyurun. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Ardından önceki adımda anlatıldığı gibi üç kez yıkayın (bkz. adım 2.3.2).
   4. BlaP-cAb-Lys3 çözeltisini bağlayıcı çözelti içinde 20 μg/mL'ye seyreltin (bkz. adım 2.1.3) ve bu seyreltilmiş çözeltiden 15 μL'lik bir damla elektrotların üzerine uygulayın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Antijen-nanokor reaksiyonundan sonra, yıkama solüsyonunu kullanarak önceki adımda tarif edildiği gibi üç kez yıkayın (bkz. adım 2.1.4). Ardından elektrodu PBS ile bir kez durulayın (bkz. adım 2.1.1).
   5. Algılama için, sensör çipini bakır devre parçası aracılığıyla dijital bir multimetreye takın. Ardından, pozitif elektrotlara 50 μL'lik bir damla algılama solüsyonu (bkz. adım 2.1.7) ve negatif elektrotlara 50 μL'lik bir damla NaCl 5 mM solüsyonu uygulayarak (bkz. adım 2.1.7) sensör yanıtını başlatın. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İletkenliği dijital bir multimetre ile izleyin.
      not: Multimetre, Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus ve Prof. Y. Glupczynski'nin (Louvain-la-Neuve Katolik Üniversitesi - CHU Mont-Godinne) tarafından sağlandı. Bu potansiyostat, bir USB portu üzerinden bilgisayar tarafından kontrol edilir ve sensörün sekiz farklı çipini aynı anda analiz eder. Yunus ve meslektaşları tarafından oluşturulan yazılım, referans ve numune elektrotları arasındaki iletkenlik farkının zamana karşı ölçümlerini temsil eden gerçek zamanlı bir çizim oluşturur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif
KH2PO4	Sigma-Aldrich	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128
NaCl (Doğal)	Sigma-Aldrich	S7653 Serisi
Tris-HCl	Roche	10812846001
Edta	Sigma-Aldrich	E9884
Kartal	Sigma-Aldrich	P9541 Serisi
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	NIST2186II
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
Alanin	Sigma-Aldrich	A7627
HCIO4	Fluka Çiçeği	34288	1M HClO4 çözümü, distribütör : Sigma-Aldrich
Kazein hidrolizatı	Sigma-Aldrich	22090
Benzilpenisilin sodyum	Sigma-Aldrich	B0900000
Tavuk yumurtası akı lizozim	Roche	10837059001
Heptan	Sigma-Aldrich	246654
metanol	Sigma-Aldrich	322415
Amonyum hidroksit çözeltisi	Sigma-Aldrich	380539	H2O'da %28NH3, çift damıtma ile saflaştırılır (konsantre?)
Laboratuvar sarf malzemeleri
6 oyuklu plaka	Greiner Bio-Bir	657165	CELLSTAR 6 Kuyulu Plaka
ekipman
pH metre	Dünya Kupası	1AA110	Laboratuvar pH ölçüm cihazı inoLab pH 7110
Vakum ve filtrasyon sistemi	Nalgene Belediyesi	NALG300-4100	Alıcılı filtre tutucular, distribütör : VWR
Potansiyometrik sensör çipleri			Yunus ve meslektaşları tarafından üretilmiştir (ref 16)
PGSTAT30 Autolab (Otomatik Laboratuvar	Metrohm Autolab Laboratuvarı		durdurulan, halefi Autolab PGSTAT302N
Dijital multimetre, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		durdurulan, halefi Metrahit Üssü

Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi )