1. Hücreler
- Prosedüre başlamadan iki gün önce, deney gününde birleşecek şekilde hücreleri gerekli yoğunlukta plakalayın. Hücreleri şişelere veya plakalara yerleştirin. Bununla birlikte, plakalardan protein ekstraksiyonu daha kolay olacaktır. Sonuçların tutarlı olduğundan emin olmak için, deney başına koşul başına en az 4 adet 78 cm2 plaka veya 2 adet 150 cm2 şişe hazırlamak uygundur.
- Bu çalışmada, Pollard ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi %2 B27, %1 N2, 20 ng/mL EGF ve b-FGF ile desteklenmiş RHB-A kök hücre ortamında kültürlenmiş 150cm2'lik 4 şişede plaka insan G166 GSC'leri incelenmiştir. Birleşmeye ulaşıldığında süreç. Örneğin, 5 x 106 G166 hücreleri 150cm2'lik bir şişeye katlandığında, kaplamadan 2 gün sonra işlenmiştir.
2. Biyotinile CPP'ler
- Kapakta tozun bir kısmının kalmasını önlemek için liyofilize biyotinile CPP'leri (BCPP'ler) içeren şişeleri 8200 x g'da 30 saniye boyunca döndürün. Bulunan etkileşimlerin hedef diziye özgü olduğundan emin olmak için bir kontrol BCPP'si ekleyin. Bu çalışmada kontrol BCPP'si TATbiotin (TAT-B) ve tedavi BCPP'si TAT-Cx43266-283-B idi. Biyotine bağlanmış karıştırılmış veya mutasyona uğramış parçalara kaynaşmış TAT gibi başka kontroller de kullanılabilir.
- BCPP'leri karşılık gelen kültür ortamında, üretici tarafından belirtilen stok çözeltisine çözün; örneğin, GSC'leri tedavi etmek için 2 mg / mL BCPP'lik bir stok çözeltisi elde etmek için, 1 mg BCPP içeren bir şişeye 0.5 mL GSC kültür ortamı ekleyin. Vorteks yapın ve peptidin iyi çözündüğünden emin olun.
3. Tüpler
NOT: Bölümde istenen koşul başına en az on iki adet 1.5 mL tüp hazırlayın.
- Koşul başına ilk 3 tüpü işaretleyin. Adım 6.4'te elde edilen toplam hücresel lizat hacmine sahip olacaklardır.
- Koşul başına 3 tüpte bir A işaretleyin. Bu tüpler, hücresel lizatların parçalanması ve döndürülmesinden sonra elde edilen ilk süpernatanlara sahip olacaktır, adım 7.2.
- Koşul başına 3 tüpte A'yı işaretleyin. Bu tüpler, ilk süpernatantların küçük bir alikotuna sahip olacaktır. Bu lizatlar, adım 7.3'te Western blot örnekleri olarak görev yapacaktır.
- Koşul başına 3 tüpte bir C işaretleyin. Bu tüpler, NeutrAvidin ile aşağı çekmeden sonra elde edilen süpernatantlara sahip olacaktır, adım 7.7.
not: Bu, Western blot'un proteinler için hiçbir sinyal göstermemesi durumunda önemlidir, yani proteinler prosedürün bir aşamasında aşağı çekilmemiş veya kaybolmuştur. Durum buysa, proteinleri aşağı çekmek için işlemi tekrarlayın.
4. BCPP'lerle hücresel tedavi
- Kültür ortamını aspire edin.
- BCPP'leri inkübasyon sürelerine göre mümkün olan en küçük hacimde inkübe etmek için gereken karşılık gelen taze besiyeri hacmini değiştirin. Her durumda, hücrelerin kurumaması için ortamın plakanın/şişenin tüm yüzeyini tamamen kaplaması çok önemlidir, örneğin 30 dakikalık bir inkübasyon için 150cm2'de 6 mL.
- Etkili olduğu kanıtlanmış konsantrasyona ulaşmak için BCPP'nin stok çözeltisinin hacmini hücre kültürlerine ekleyin. Bu çalışmada, 50 μM TAT-Cx43266-283-B'nin GSC proliferasyonunu azalttığı kanıtlanmıştır.
- Bu nedenle, 50 μM TAT-Cx43 266-283-B'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için mL kültür ortamı başına 92.8 μL 2 mg / mL TAT-Cx43266-283-B (MW = 3723.34 g / mol) ekleyin. Eklenecek hacim kontrol peptitleri için farklıysa, aynı son hacme kadar kültür ortamı ile tamamlayın. Örneğin, 50 μM TAT-B'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için mL kültür ortamı başına 49.1 μL TAT-B (MW = 1914.31 G / MOL) ARTı 43.7 ΜL GSC ortamı eklendi.
- BCPP ve hücre içi ortakları arasındaki etkileşimlerin gerçekleştiğinden emin olmak için hücreleri 30 dakika boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübatöre yerleştirin. Etkileşim daha uzun sürerse, daha uzun süreler boyunca kuluçkaya yatırın veya deneyin bir zaman seyrinden oluşması durumunda süreleri ayarlayın. Ek olarak, farklı hücre içi sinyal yollarının uyarılmasıyla ilginin etkileşimi teşvik edilebilir veya önlenebilir.
5. Tamponlar ve çözeltiler
- PBS pH 7.4'ü hazırlayın: 136 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 7.8 mM Na2 HPO4·2H2O; 1.7 mM KH2PO4.
- Protein lizis tamponu hazırlayın: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 137 mM NaCl, %1 IGEPAL, Kullanmadan önce aşağıdakileri ekleyin: 1/100 (h/h) Proteaz İnhibitörü Kokteyli, 1 mM Sodyum Florür, 1 mM Fenilmetansülfonil florür (PMSF) ve 0.1 mM Sodyum ortovanadat.
- Laemmli tamponu hazırlayın: (4x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M gliserol; %3.7 SDS (p/h); 0.6 M β-merkaptoetanol veya 9 mM DTT; %0.04 (h/h) bromofenol mavisi (BB)).
6. Protein ekstraksiyonu
>NOT: Protein ekstraksiyonu daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Prosedürün tüm bu bölümünü 4 °C'de gerçekleştirin.
- Kültür ortamını tamamen aspire edin.
- Hücre ayrılmasını önlemek için 3 x 10 mL'yi 150cm2'ye kadar buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile çok dikkatli bir şekilde yıkayın.
- Hücre lizatını elde etmek için, 150cm2'ye 3 mL lizis tamponu ekleyin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak yüzeyi iyice kazıyın. Plakayı/şişeyi yaklaşık 45 dereceye kadar eğmek, hücre lizatlarının karşılık gelen tüplerine toplanmasını kolaylaştıracaktır.
- Tüp başına 1 mL hücresel lizatı üç adet 1.5 mL tüpe dökün. Bu tüpler, adım 3.1'de belirtildiği gibi koşul ve replikat ile işaretlenecektir.
7. Aşağı açılır
- 1.5 mL'lik tüpleri 11.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanları yeni tüplere (A) aktarın.
- Bu süpernatantın her koşulda farklı tüplere (B), yani tüp başına 50 μL'ye bir alikotunu alın. 4x Laemmli tamponu (50 μL lizat için 16.6 μL) ekleyin ve -20 °C'de dondurun. Bu lizatlar, her zamanki Western blot örnekleri olarak hizmet edecektir.
- NeutrAvidin Agaroz'u hafifçe çalkalayarak çok iyi homojenize edin. Çaplarını artırmak ve boncukların pipetlenmesini iyileştirmek için pipet uçlarının uçlarını kesin. (A) tüplerinde mL hücre lizatı başına 50 μL NeutrAvidin Agaroz ekleyin.
- NeutrAvidin'in hücre içi ortaklarına bağlı BCPP'lerle etkileşime girmesine izin vermek için çok hafif çalkalama ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- NeutrAvidin kompleksini proteinlerle toplamak için 3.000 x g'da 4 ° C'de 1 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanları dikkatlice çıkarın ve temiz tüplere (C) aktarın. Aşağı çekmenin başarılı olmaması durumunda kullanmak için saklayın.
- Yıkama adımları: peletlere (tüp A) taze lizis tamponu ekleyin, ters çevirerek yeniden süspanse edin ve 7.6 ve 7.7 adımlarını beş kez daha tekrarlayın. Bütün bu süpernatantlar atılabilir.
- Süpernatanları çıkarın ve istenen nihai hacme 2x Laemmli tamponu ekleyin (cm2 şişeleri birleşik hücrelerden elde edilen peletler için 1.5 mL tüp başına 40 μL).
- Proteinler ve santrifüj arasındaki etkileşimleri ayırmak için 100 °C'de 5 dakika boyunca 8.200 x g'da 30 saniye boyunca NeutrAvidin boncuklarını peletlemek için elute edin.
- Ayrışmış proteinleri içeren süpernatanları kılcal uçlarla yeni tüplere (D) alın. Boncuklar, tekrarlayan elüsyon adımlarının gerekli olması durumunda saklanabilir.
not: Süpernatantlar (tüp D) artık Western blot'a yüklenmeye veya -20 °C'de donmaya hazırdır.
