Maya Hücrelerinde Protein Kendi Kendine İlişkilendirmeyi Belirlemek için Maya İki Hibrit Testi

Özet

Kaynak: Stanczyk, P. J., et al., Protein Oligomerizasyonunun İn Vivo ve İn Vitro Değerlendirmesi için Genetik ve Biyokimyasal Yaklaşımlar: Ryanodin Reseptörü Vaka Çalışması. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, belirli protein öz etkileşimlerini tespit etmek için maya iki hibrit testini göstermektedir. Bu tahlilde, ilgilenilen protein, β-galaktosidaz enzimini kodlayan bir transkripsiyon faktörünün iki alanına etiketlenir. İki protein etkileşime girdiğinde, bu, daha sonra bir biyokimyasal tahlil kullanılarak tespit edilen enzimi oluşturmak için transkripsiyon ve translasyona neden olur.

Protokol

1. Maya Dönüşümü

1. Mayayı santrifüjleme ile (50 ml'lik tüplerde) 1.500 x g'da RT'de 5 dakika hasat edin. Süpernatanı atın, her peleti 5 ml steril H₂O içinde yeniden süspanse edin ve birlikte toplayın.
2. RT'de 5 dakika boyunca 1.500 x g'da yeniden santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Maya peletini 1 ml taze hazırlanmış, steril 1x LiAc/TE.
   içinde tekrar süspanse edin not: Hazırlandıktan sonraki 1 saat içinde yetkili maya hücrelerini kullanın.
3. Tek dönüşümler için 200 ng plazmit DNA veya ko-dönüşümler için her bir plazmit DNA'sından 0.5 - 1 μg ve 100 μg ringa balığı testis taşıyıcı DNA'sı (20 dakika kaynatılır ve kullanımdan hemen önce buz üzerinde soğutulur) ekleyerek plazmit örneklerini (1.5 ml'lik tüplerde) hazırlayın.
   NOT: Pozitif bir kontrol ekleyin, ör., pVA3 (p53 proteini ile GAL4 DNA-BD füzyonunu kodlayan) ve pTD1 (SV40 büyük T antijeni ile GAL4 AD füzyonunu kodlayan) ile birlikte transforme edilmiş maya.
4. 100 μl taze hazırlanmış, yetkin maya süspansiyonu ve 600 μl 1x LiAc/PEG çözeltisi (8 ml stok PEG 3350, 1 ml stok TE, 1 ml stok LiAc) ekleyin ve ~ 30 saniye vorteksleyin 30 ° C'de 30 dakika inkübe edin ve 200 rpm'de çalkalayın.
5. 80 μl dimetil sülfoksit (%10 v/v nihai konsantrasyon) ekleyin ve hafifçe ters çevirerek iyice karıştırın. Her 2-3 dakikada bir karıştırırken 42 ° C'lik bir su banyosunda 15 dakika boyunca ısı şoku.
6. Mayayı geri kazanmak için hücre süspansiyonunu buz üzerinde 2 dakika soğutun ve RT'de 15 saniye boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
7. Hücre peletini 100 μl 1x TE'de yeniden süspanse edin ve seçici büyüme için uygun minimal SD orta plakalara plaka verin (hem yem hem de hedef plazmitler üzerinde seçici baskı tutmak için orta lösin ve triptofan eksik).
8. Kolonilerin çapı ~2 mm olana kadar (genellikle 4-5 gün) plakaları 30 °C'de baş aşağı inkübe edin. Plakalar 4 ° C'de 2 - 3 hafta saklanabilir; daha uzun süre saklamak için gliserol stokları yapın ve -80 °C.
   'de saklayın not: Yem ve hedef proteinlerin immünoblotlama ile mayada eksprese edildiğini ve mayada ayrı ayrı eksprese edildiklerinde otonom raportör gen aktivasyonuna sahip olmadıklarını doğrulayın.
9. 100 μl taze hazırlanmış, yetkin maya süspansiyonu ve 600 μl 1x LiAc/PEG çözeltisi (8 ml stok PEG 3350, 1 ml stok TE, 1 ml stok LiAc) ekleyin ve ~ 30 saniye vorteksleyin 30 ° C'de 30 dakika inkübe edin ve 200 rpm'de çalkalayın.
10. 80 μl dimetil sülfoksit (%10 v/v nihai konsantrasyon) ekleyin ve hafifçe ters çevirerek iyice karıştırın. Her 2-3 dakikada bir karıştırırken 42 ° C'lik bir su banyosunda 15 dakika boyunca ısı şoku.
11. Mayayı geri kazanmak için hücre süspansiyonunu buz üzerinde 2 dakika soğutun ve RT'de 15 saniye boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin.
12. Hücre peletini 100 μl 1x TE'de yeniden süspanse edin ve seçici büyüme için uygun minimal SD orta plakalara plaka verin (hem yem hem de hedef plazmitler üzerinde seçici baskı tutmak için orta lösin ve triptofan eksik).
13. Kolonilerin çapı ~2 mm olana kadar (genellikle 4-5 gün) plakaları 30 °C'de baş aşağı inkübe edin. Plakalar 4 ° C'de 2 - 3 hafta saklanabilir; daha uzun süre saklamak için gliserol stokları yapın ve -80 °C.
    'de saklayın NOT: Yem ve hedef proteinlerin immünoblotlama yoluyla mayada eksprese edildiğini ve mayada ayrı ayrı eksprese edildiklerinde otonom raportör gen aktivasyonuna sahip olmadıklarını doğrulayın.

2. Koloni kaldırma filtre kağıdı β-Gal Testi

1. Aşağıdaki arabellekleri hazırlayın:
   1. 100 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl ve 1 mM MgM_S04 içeren bir Z-tamponu hazırlayın; pH'ı 7.4'e ayarlayın. Otoklavlayarak sterilize edin ve RT'de saklayın.
   2. 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosidi N, N-dimetilformamid içinde 20 mg / ml'de çözerek X-Gal tamponunu hazırlayın ve karanlıkta -20 ° C'de saklayın. Z tamponu / X-Gal çözeltisi hazırlayın. Kullanmadan önce Z-tamponunda 0.33 mg / ml'de X-Gal ve %0.27 v / v'de β-merkaptoetanolü karıştırarak tampon yapın. Örnek başına 2,5 ml kullanın.
2. 100 mm'lik temiz bir plakaya 2,5 ml taze hazırlanmış Z tamponu/X-Gal solüsyonu ekleyin ve bir selüloz filtre kağıdının içine yerleştirin.
3. Tahlil edilecek maya kolonileri ile plakanın yüzeyine yeni bir filtre kağıdı yerleştirin. Filtre kağıdını forseps ile plakaya nazikçe ovalayın ve kolonilerin yapışması için ~ 5 dakika bekletin.
   not: Pozitif kontrolü paralel olarak işleyin, yani mayayı pVA3 ve pTD1 ile birlikte dönüştürün.
4. Filtre kağıdını kaldırın ve (forseps ile) 30 saniye boyunca sıvı nitrojen havuzuna daldırın (sıvı nitrojen dikkatli kullanılmalıdır; daima kalın eldiven ve gözlük takın). Donmuş filtre kağıdının RT'de ~2 dakika çözülmesine izin verin.
5. Filtre kağıdını (koloni tarafı yukarı bakacak şekilde) 100 mm'lik plakanın içindeki önceden ıslatılmış filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve 30 °C'de inkübe edin.
6. Mavi kolonilerin görünümünü periyodik olarak (her ~ 30 dakikada bir) kontrol edin.
   not: Zayıf yem: hedef etkileşimlerin pozitif bir mavi sinyal üretmesi birkaç saat sürebilir (yanlış pozitif sonuçlar verebilecek uzun süreli inkübasyondan (>8 saat) kaçının). En iyi sonuçlar için, taze dönüştürülmüş koloniler kullanın, yani 30 ° C'de 4 - 5 gün boyunca yetiştirilmiş, ~ 2 mm çapında.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Plaka inkübatörü	İşte	B6120	aygıt
Orbital çalkalayıcı kuluçka makinesi	New Brunswick Bilimsel	İNNOVA 4300	aygıt
Spektrofotometre	Perkin Elmer	Lambda Biyo+	aygıt
Çöpçatan İki Hibrit Sistem 2 Kiti	Takara Clontech	K1604-1	Yem vektörü pGBKT7, av vektörü pACT2 ve maya suşu Y190 içerir
Maya Azot Baz	Sigma-Aldrich	Y0626	Minimum SD yetiştirme ortamı hazırlamak için
Lösin ve triptofan içermeyen bırakma takviyesi	Sigma-Aldrich	Y0750 Serisi	Minimum SD yetiştirme ortamı hazırlamak için
Lösin, triptofan, histidin içermeyen bırakma takviyesi	Sigma-Aldrich	Y2001 Serisi	Minimum SD yetiştirme ortamı hazırlamak için
Ringa balığı testisleri taşıyıcı DNA	Takara Clontech	630440	Maya dönüşümü için
Whatman filtre kağıdı Sınıf 5	Sigma-Aldrich	WHA1005070	Koloni kaldırma filtre kağıdı β-Gal tahlilinde kullanım için
X-Gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid)	Sigma-Aldrich	B4252	Koloni kaldırma filtre kağıdı β-Gal tahlilinde kullanım için

Serisi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi