Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Tandem Afinite Saflaştırma Testi

Özet

Kaynak: Ma, Z., et al. Ökaryotik Hücrelerden Protein Komplekslerinin Tandem Afinite Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, protein-protein etkileşimini incelemek için ökaryotik hücrelerden protein komplekslerini saflaştırmaya yönelik bir teknik olan tandem afinite saflaştırmasını göstermektedir. Kompleks, farklı epitop etiketleriyle etiketlenmiş iki protein içerir. Kompleksin, iki farklı etiket için bir afiniteye sahip iki reçine kullanılarak sıralı bir şekilde saflaştırılması üzerine, elütede her iki proteinin varlığı, ikisi arasındaki etkileşimi doğrular.

Protokol

1. Kaplama Hücreleri

1. Transfeksiyondan bir gün önce, 10 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde 3.5 x 10 6 HEK293T hücre plakalandırın, %10 (h/h) fetal sığır serumu (FBS) ve %1 (h/h) penisilin / Streptomisin (10.000 U / ml stok) 100 mm'lik çanak başına. Plaka 3 - 5 100 mm Yeterli protein geri kazanımını sağlamak için deney/koşul başına² tabak.
   not: Her deney/koşul için plaka sayısı belirlenmelidir, bu da ilgilenilen protein kompleksinin ekspresyon seviyelerine ve çözünürlüğüne dayanacaktır. Alternatif olarak, daha büyük ölçekli saflaştırmaya ihtiyaç duyulursa, hücre hatları, eğirme şişelerindeki süspansiyonlarda büyüyecek şekilde uyarlanabilir, ancak bu yöntem geçici transfeksiyonlar için işe yaramayacaktır.

2. Hücreleri Dönüştürme veya Kararlı Hücre Hatlarını İndükleme

1. Ertesi gün, hücreleri mikroskop altında kontrol edin. Devam etmeden önce hücreler% 70 - 80 birleşik olmalıdır.
2. Hücreleri, 100 mm'lik bir tabak başına toplam 7 μg plazmit DNA ve 21 μl transfeksiyon reaktifi karışımı ile transfekte edin. Transfeksiyon verimliliği için bir kontrol olarak GFP'yi (Tablo 1) ifade eden bir vektöre sahip transfekt hücreler.
   not: Doksisikline yanıt olarak iki veya daha fazla karmaşık alt birimin ekspresyonunu indükleyen bir HEK293-T-REx veya benzeri kararlı hücre hattı kullanılıyorsa, indükleyicinin hücrelere eklenmesi ve 48 saat inkübe edilmesi gerekecektir. Benzer şekilde, indükleyicinin eklenmesi üzerine GFP'nin ekspresyonunu indükleyen kararlı bir hücre hattı da doğrulama amaçları için gerekli olacaktır. Adım 2.7'ye geçin.
3. Transfeksiyon karışımını 100 mm'lik tabak başına hazırlayın. 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 500 μl takviye edilmemiş DMEM'i 7 μg toplam plazmit DNA (iki veya daha fazla plazite karşılık gelir) ile karıştırın. Ayrı bir mikrosantrifüj tüpünde, 500 μl takviye edilmemiş DMEM'i 21 μl transfeksiyon reaktifi ile karıştırın. Her transfeksiyon reaksiyonu için tekrarlayın.
4. Transfeksiyon reaktif çözeltisini plazmit DNA çözeltisine pipetleyin (çözeltileri ters sırada karıştırmayın). En az 4 kez pipetleyerek karıştırın.
5. Bu karışımı oda sıcaklığında 10-15 dakika, ancak 15 dakikadan fazla olmamak üzere inkübe edin.
6. Bir ortam haznesi oluşturmak için plakayı eğin ve transfeksiyon karışımını, hücreleri rahatsız etmeden plakanın iç tarafına damla damla dikkatlice pipetleyin. Çanağı orijinal düz konumuna geri getirin ve karışımı dağıtmak için hafifçe döndürün.
7. Hücreleri 37 °C'de% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin (bu durum bundan böyle "doku kültürü inkübatörü" olarak anılacaktır). Ortamı transfeksiyondan 5 saat sonra değiştirin (isteğe bağlı).

3. Transfeksiyon veya İndüksiyon Verimliliğini Kontrol Etme

1. Transfeksiyondan 24 saat sonra, transfeksiyon verimliliğini kontrol etmek için hücreleri bir floresan mikroskobu altında görselleştirin (veya GFP'yi ifade eden kontrol HEK293T-REx kararlı hücre hattının indüksiyonu). 24 saat daha kuluçkaya yatırın.

4. STREP Afinite Saflaştırması (STREP AP)

1. Hücrelerin toplanması
   1. Transfeksiyondan 48 saat sonra, ortamı çıkarın ve 8 ml soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Hücreleri plakadan ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
   2. Hücre süspansiyonunu toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve hücreleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 800 x g'da döndürün.
   3. PBS süpernatantını çıkarın. Kalan PBS'yi ortadan kaldırmak için sıkma işlemini tekrarlayın (4 ° C'de 1 dakika boyunca 800 x g). Hücre peletini ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın veya protein saflaştırmasına devam etmek için aşağıdaki prosedürü izleyin.
2. Hücrelerin parçalanması
   1. Pasif Lizis Tamponu (PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, proteaz inhibitörü kokteyl tableti, %5 v/v gliserol ve %1.0 NP-40) hücre pelet hacminin 5'× kullanarak hücre peletlerini yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   2. Süspansiyonu kısaca girdaplayın ve 4 °C'de 30 dakika boyunca nutat yapın.
   3. Hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da döndürün.
   4. Çözünür lizatları 1.5 ml'lik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücre peletlerini atın. Çözünür lizatın son hacminin %10'unu "STREP AP Girişi" olarak kaydedin. 4 °C'de saklayın.
3. STREP boncuklarının dengelenmesi
   not: İlk AP adımı için STREP boncuklarını kullanın! STREP boncukları ile aşağı çekilen kompleksler, FLAG boncukları ile aşağı çekilenlerden önemli ölçüde daha fazla protein geri kazanır.
   1. % 50 STREP boncuk bulamacından (n = numune sayısı) (n × 40 μl) + n μl'yi çıkarın ve 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.500 x g'da döndürün.
      NOT: Boncukları pipetlemek için geniş ağızlı uçlar kullanın.
   2. Süpernatanı çıkarın ve boncuklara 500 μl PLB ekleyin. Boncuk karışımını 4 ° C'de 5 dakika boyunca nutate edin. 1,500 x g'da 4 ° C'de 2 dakika döndürün.
      1. Toplam 3 yıkama için tekrarlayın. PLB'deki boncukları n × 40 μl'lik bir nihai hacme kadar yeniden süspanse edin.
   3. Her hücre lizat örneğine 40 μl %50 STREP boncuk bulamacı ekleyin ve 4 ° C'de 2 saat nutat edin.
4. STREP AP
   1. Çözeltiyi 1,500 ° C'de 2 dakika boyunca 4 x g'da döndürün.
   2. Süpernatanı çıkarın ve 4 °C'de "STREP AP Flow-through (FT)" olarak saklayın.
   3. Boncuklara 500 μl STREP AP Yıkama Tamponu I (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, %5 gliserol ve %0.2 NP-40) ekleyin. Boncuk karışımını 4 ° C'de 5 dakika nutekleyin ve 1,500 x g'da 4 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
      1. Toplam 4 yıkama için tekrarlayın.
         not: Dördüncü yıkamadan önce, protein arka planını azaltmak için boncuk çözeltisini yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu adım çok önemlidir.
   4. 500 μl Yıkama Tamponu II (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl ve 1 mM EDTA) ekleyin ve tüpleri ters çevirerek boncukları dengeleyin. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.500 x g'da döndürün ve süpernatanı atın.
   5. 50 μl STREP Elüsyon Tamponu (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ve 2.5 mM Desthiobiotin) ile ilgilenilen proteini ortaya çıkarın. 4 °C'de 15 dakika boyunca 800 rpm'de girdap.
   6. Boncukları 4 ° C'de 1 dakika boyunca 1.500 x g'da döndürün. Süpernatanı toplayın. Bu fraksiyon "STREP AP Elütion" örneğine karşılık gelir.
   7. Boncuk fraksiyonunu ikinci bir elüsyon için 4 °C'de saklayın, bu da ilk elüsyonla elde edilen protein miktarının yarısına kadarını verebilir. Gümüş boyama ve / veya batı lekeleme için STREP AP Elution'ın% 10'unu alın.
5. BAYRAK boncuklarının dengelenmesi
   1. (n x 16 μl) + n μl FLAG boncuk solüsyonunu (n = numune sayısı) çıkarın ve 4 °C'de 2 dakika boyunca 1.500 x g'da döndürün.
      not: Boncukları pipetlemek için geniş ağızlı uçlar kullanın.
   2. Süpernatanı çıkarın ve boncuklara 500 μL FLAG yıkama tamponu (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA ve %0.1 NP-40) ekleyin. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.500 x g'da aşağı döndürün. Toplam 3 yıkama için tekrarlayın.
   3. FLAG yıkama tamponundaki boncukları n x 16 μl'lik bir nihai hacme kadar yeniden süspanse edin.
   4. Kalan STREP AP elüsyonuna 16 μl FLAG boncuk bulamacı ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de nütüre edin.

5. IP BAYRAK

1. FLAG boncuk süspansiyonunu 1,500 °C'de 2 dakika boyunca 4 x g'da döndürün. Süpernatanı kaydedin ve 4 °C'de "FLAG IP Flow-through" (FT) olarak saklayın.
2. Çözeltiye 500 μl FLAG yıkama tamponu ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika nutat ve 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüjleyin. Toplam 4 yıkama için tekrarlayın ve her yıkamadan sonra süpernatanı çıkarın.
   not: Dördüncü yıkamadan önce, arka planı azaltmak için protein boncuk çözeltisini yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu adım çok önemlidir.
3. Süpernatanı son dönüşten çıkarın ve boncuklara 200 ng/μl FLAG peptit içeren 30 μL FLAG yıkama tamponu ekleyin. 4 °C'de 2 saat boyunca 800 rpm'de girdap.
4. Süspansiyonu 1,500 °C'de 2 dakika boyunca 4 x g'da döndürün. Süpernatanı hasat edin ve 4 °C'de "FLAG IP Elution" olarak saklayın.
   not: Elüsyon örnekleri, standart protokoller kullanılarak gümüş leke ve / veya western blot ile doğrulanabilir ve daha ileri protein tahlilleri için hazırdır. Bir western blot kurarken, aşağıdaki örneklerin tümünü çalıştırın: (1) STREP AP Girişi, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elution, (4) FLAG IP FT ve (5) FLAG IP Elution. Her deney için yüklenen hacimlerin belirlenmesi gerekecektir. Toplanan tüm numuneler ve boncuklar kısa süreli depolama için 4 °C'de ve uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanabilir. TAP numuneleri, bileşenlerinin kimliğini doğrulamak, yeni translasyon sonrası modifikasyonları (PTM'ler) tanımlamak ve/veya saflaştırılmış kompleks ile herhangi bir yeni protein etkileşimini keşfetmek için kütle spektrometresi ile analiz edilebilir. Bu amaçla, bir coomassie jeli veya gümüş lekesi çalıştırdıktan sonra, bantlar temiz bir neşter kullanılarak jelden çıkarılabilir. Kütle spektrometresi yöntemlerini tartışan birkaç mükemmel inceleme daha önce yayınlanmıştı.

Sonuçlar

Tablo 1: Bu Çalışmada Kullanılan Plazmitler. CycT1 ve CDK9, pcDNA/4TO-STREP ve pcDNA/4TO-FLAG plazmit vektörlerine bağlandı. Bu yapılar DH5α yetkin hücrelere dönüştürüldü ve LB-Ampisilin plakaları üzerine kaplandı. Koloniler seçildi, büyütüldü ve tarandı. Başarılı bir şekilde bağlanan klonlar, Sanger dizilemesi ve kısıtlama sindirimi ve agaroz jel elektroforezi kombinasyonu ile doğrulandı. CycT1 için tam uzunluk (1 - 708) yerine daha kısa bir versiyon (1 - 726) kullandık çünkü son 18 kalıntı bir PEST dizisi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)	Balıkçı Bilimsel	SH30022FS
Fetal sığır serumu	Klon	SH30071
Penisilin / Streptomisin	Balıkçı Bilimsel	MP091670049
PolyJet (Çoklu Jet)	Balıkçı Bilimsel	50-478-8
Proteaz inhibitörü kokteyli	Roche	11836153001
STREP-Daktin Süper Akışı	Içer	2-1208-010
STREP etiketi elüsyon tamponu	Içer	2-1000-025
EZview Kırmızı ANTI-FLAG M2 Afinite Jeli	Sigma	SLBQ1981V
Corning 100mm × 20 mm stil Çanak hücre kültürü ile muamele edilmiş pirojenik olmayan polistiren 20 / kol	Corning	430167
Protein Lo-Bind Eppendorf	Balıkçı Bilimsel	13-698-794
Dijital Vorteks Karıştırıcı	Balıkçı Bilimsel	02-215-370
48 delikli mikro tüp köpük raf	Balıkçı Bilimsel	02-215-386
Labquake çalkalayıcı et lokantası	Termo	415110