Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Tandem Afinite Saflaştırma Testi

Özet

Kaynak: Ma, Z., et al. Ökaryotik Hücrelerden Protein Komplekslerinin Tandem Afinite Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, protein-protein etkileşimini incelemek için ökaryotik hücrelerden protein komplekslerini saflaştırmaya yönelik bir teknik olan tandem afinite saflaştırmasını göstermektedir. Kompleks, farklı epitop etiketleriyle etiketlenmiş iki protein içerir. Kompleksin, iki farklı etiket için bir afiniteye sahip iki reçine kullanılarak sıralı bir şekilde saflaştırılması üzerine, elütede her iki proteinin varlığı, ikisi arasındaki etkileşimi doğrular.

Protokol

1. Kaplama Hücreleri

1. Transfeksiyondan bir gün önce, 10 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde 3.5 x 10 6 HEK293T hücre plakalandırın, %10 (h/h) fetal sığır serumu (FBS) ve %1 (h/h) penisilin / Streptomisin (10.000 U / ml stok) 100 mm'lik çanak başına. Plaka 3 - 5 100 mm Yeterli protein geri kazanımını sağlamak için deney/koşul başına² tabak.
   not: Her deney/koşul için plaka sayısı belirlenmelidir, bu da ilgilenilen protein kompleksinin ekspresyon seviyelerine ve çözünürlüğüne dayanacaktır. Alternatif olarak, daha büyük ölçekli saflaştırmaya ihtiyaç duyulursa, hücre hatları, eğirme şişelerindeki süs....

Sonuçlar

Tablo 1: Bu Çalışmada Kullanılan Plazmitler. CycT1 ve CDK9, pcDNA/4TO-STREP ve pcDNA/4TO-FLAG plazmit vektörlerine bağlandı. Bu yapılar DH5α yetkin hücrelere dönüştürüldü ve LB-Ampisilin plakaları üzerine kaplandı. Koloniler seçildi, büyütüldü ve tarandı. Başarılı bir şekilde bağlanan klonlar, Sanger dizilemesi ve kısıtlama sindirimi ve agaroz jel elektroforezi kombinasyonu ile doğrulandı. CycT1 için tam uzunluk (1 - 708) yerine daha kısa bir versiyon (1 - 726) kullandık çünkü son 18 kalıntı bir PEST dizisi.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)	Balıkçı Bilimsel	SH30022FS
Fetal sığır serumu	Klon	SH30071
Penisilin / Streptomisin	Balıkçı Bilimsel	MP091670049
PolyJet (Çoklu Jet)	Balıkçı Bilimsel	50-478-8
Proteaz inhibitörü kokteyli	Roche	11836153001
STREP-Daktin Süper Akışı	Içer	2-1208-010
STREP etiketi elüsyon tamponu	Içer	2-1000-025
EZview Kırmızı ANTI-FLAG M2 Afinite Jeli	Sigma	SLBQ1981V
Corning 100mm × 20 mm stil Çanak hücre kültürü ile muamele edilmiş pirojenik olmayan polistiren 20 / kol	Corning	430167
Protein Lo-Bind Eppendorf	Balıkçı Bilimsel	13-698-794
Dijital Vorteks Karıştırıcı	Balıkçı Bilimsel	02-215-370
48 delikli mikro tüp köpük raf	Balıkçı Bilimsel	02-215-386
Labquake çalkalayıcı et lokantası	Termo	415110