$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu çalışma için, CV-N yerine enzime bağlı immünosorbent testlerinde CVN-küçük ubikitin benzeri bir değiştirici (SUMO) füzyon proteini kullanılmıştır ve hücre bazlı testler için uygundur. Rekombinant tam uzunlukta influenza A virüsü HA H3 proteini ticari olarak elde edilir (Malzeme Tablosuna bakınız) veya standart protokollere göre memeli HEK293 hücre hatlarında ve bakulovirüs ile enfekte böcek hücrelerinde eksprese edilir. Wuhan-1 spike proteini, memeli HEK293 hücrelerinde eksprese edilir. Mon-mannosile peptit (MM) ve di-mannosile peptit (DM) sentezi, homojen ligandların CVN2 ve mono-mannosile edilmiş küçük moleküllere saptanmasını sağlar.
1. CV-N yapıları oluşturma
- CVN2 varyantlarının ve CVN2L0 proteininin (PDB ID 3S3Y) her biri için, ticari kaynaklardan pET27b (+) vektöründe bir N-terminal pelB lider dizisi ve His-tag ile gen yapısını elde edin (bakınız Tablo 1).
- CVN2L0 ve türevlerini (V2, V3, V4 ve V5; Şekil 1A,C), her CV-N tekrarı için iki farklı DNA dizisinden oluşan bir CVN2L0 şablon geninin arka planında.
- Liyofilize plazmit DNA'yı steril deiyonize distile suda (ddH2O) 100 ng / μL'lik bir nihai konsantrasyona çözün.
2. Plazmid DNA transforme edilmiş hücreler ile LB-agar plakalarının hazırlanması
- 10 g/L pepton, 5 g/L maya özütü ve 5 g/L NaCl'yi ddH 2O'da çözerek kültür ortamı LB-Lennox'u hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve pH'ı 7.4'e ayarlayın. Daha önce yayınlanmış bir raporu takiben kimyasal yöntemle her varyant (V2-V5) için yetkin E. coli BL21'e (DE3) dönüşümü gerçekleştirin.
- Çözeltiyi bölün (900 μL ve 100 μL), 100 μL'yi LB-agar plakalarına (50 μg / mL kanamisin) aktarın ve nazikçe steril bir hücre yayıcı kullanın. Agar plakalarını gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
3. Klonlama
- CV-N genini, referansı takiben elektroyetkin hücrelere dönüşüm (elektroporasyon) için pET11a'nın NdeI ve BamHI bölgelerine (Malzeme Tablosuna bakınız) alt klonlayın.
4. Siteye yönelik mutajenez
- Her CV-N tekrarı için iki ayırt edici DNA dizisi içeren bir CVN2L0 şablon geninin arka planında CVN2L0 ve mutant CVN-E41A oluşturmak için.
- PCR'yi çalıştırmak için bölgeye yönelik bir mutajenez kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) ve spesifik mutajenik primerler 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' ve 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' kullanarak mutasyonlar yapın.
- 5-50 ng arasında değişen çoklu konsantrasyonlarda çift sarmallı DNA (dsDNA) şablonu kullanarak bir dizi numune reaksiyonu başlatın (örneğin, 5, 10, 20 ve 50 ng dsDNA şablonu). Astar konsantrasyonunu sabit tutun.
not: PCR karışımı ve termal döngü protokolü genellikle sahaya yönelik mutajenez kitinin kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi kullanılır.
- DpnI kısıtlama enzimini (1 μL, 10 U/μL, Malzeme Tablosuna bakınız) mineral yağ kaplamasının altına ekleyin. Reaksiyonları iyice ve nazikçe karıştırın, masa üstü bir mikrosantrifüjde 1 dakika döndürün ve ebeveyn süper sarmal dsDNA'yı sindirmek için hemen 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
5. Bakteri hücrelerinin dönüşümü
- XL1-Blue süper yetkin hücreleri (Malzeme Tablosuna bakın) buz üzerinde nazikçe çözdürün. Her bir kontrol ve numune reaksiyonunu dönüştürmek için, süper yetkin hücreleri (50 μL) önceden soğutulmuş bir polipropilen yuvarlak tabanlı tüpe (14 mL) ayırın.
- Her kontrolden ve numune reaksiyonundan (mutasyona uğramış ssDNA) 1 μL'lik Dpn I ile muamele edilmiş tek sarmallı DNA'yı (ssDNA), tamamlayıcı ipliği sentezleyen süper yetkin hücrelerin ayrı alikotlarına aktarın. Reaksiyonları buz üzerinde 30 dakika boyunca karıştırmak ve inkübe etmek için dönüşüm reaksiyonlarını dikkatlice döndürün
not: Dpn I ile muamele edilmiş DNA'yı transformasyon reaksiyonuna aktarmadan önce, kalan mineral yağın pipet ucundan dikkatlice çıkarılması önerilir. İsteğe bağlı bir kontrol olarak, XL1-Blue süper yetkin hücrelerin dönüşüm verimliliğinin, 0.1 ng/μL pUC18 kontrol plazmidi (1 μL) ile süper yetkin hücrelerin 50 μL'lik bir alikotu karıştırılarak kontrol edilmesi gerekir.
- Dönüşüm reaksiyonlarına 42 ° C'de 45 saniye boyunca ısı darbesi uygulayın ve ardından reaksiyonları 2 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin
not: Uygulanan ısı darbesi, polipropilen yuvarlak tabanlı borularda (14 mL) belirtilen koşullar için zaten optimize edilmiştir.
- 0.5 mL NZY + et suyu ekleyin (litre başına içeren: 10 g NZ amin (kazein hidrolisat), 5 g maya özütü, 5 g NaCl, 12.5 mL 1 M MgCl2, 12.5 mL 1 M MgSO4, 10 mL 2 M glikoz, pH 7.5 ve 42 ° C'ye önceden ısıtılmış) ve dönüşüm reaksiyonlarını 37 ° C'de 225-250 rpm'de 1 saat çalkalayarak inkübe edin. Doğru hacimde plaka LB-ampisilin agar plakaları üzerindeki her transformasyon reaksiyonu (kontrol plazmid dönüşümünden 5 μL; numune transformasyonundan 250 μL).
not: Transformasyon kontrolleri ve mutajenez için, hücreleri 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid (X-gal, 80 μg / mL) ve izopropil-1-tiyo-β-D-galaktopiranosid (IPTG, 20 mM) içeren LB-ampisilin agar plakalarına yayın (bkz. Analizler için mutasyona uğramış plazmit DNA'yı saflaştırmak için hücre kültürlerinin 50 mL'sini tek bir dönüştürülmüş E. coli hücresi kolonisi ile aşılayın. Mutajenez, harici bir tesiste DNA dizilimi ile doğrulanır.
6. Ekspresyon ve protein saflaştırması
- Büyük ölçekli bir kültür için, dönüştürülmüş plakadan tek bir koloni ile az miktarda LB (ampisilin içeren) aşılayın.
- Gece boyunca kültürü kullanarak, ekspresyon kültürünü 10 mM MgCl2, 10 mM MgS04 ve 20 mM glikoz gibi katkı maddeleri ile aşılayın ve tohum kültürünü 1/100'e kadar seyreltin.
- Hücreleri 37 ° C'de kuvvetli çalkalama ile büyütün. Hücreleri 20 ° C'ye soğutmadan önce 0.4-0.6 (orta log fazı) arasında bir Abs 600 nm'ye kadar büyütün. 1 mM IPTG ile indükleyin ve gece boyunca büyütün.
- Daha sonra, hücreleri 4,000 ° C'de 15 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyerek hasat edin ve süpernatantı bir pipetle atın.
- Hücre peletini fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) tamponunda yeniden süspanse edin ve 4,000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika boyunca yeniden santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı bir pipetle atın. Kalan peleti 10 mL lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
not: Lizis tamponunun bileşimi: (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl,% 2 Triton-X 100, 500 ng / mL lizozim, 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF), 1 mM ditiyotreitol, 1 mM MgCl2, pH 8, Malzeme Tablosuna bakınız).
- Karışımı iki donma-çözülme döngüsüne (-80 °C) tabi tutun. Çözünür ve çözünmez fraksiyonları 4,000 ° C'de 15 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleme ile ayırın ve bunları poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), özellikle sodyum dodesil sülfat (SDS) -PAGE kullanarak analiz edin (Şekil 1B, C).
not: Hücreler, donma-çözülme, sonikasyon, homojenizasyon, enzimatik liziz veya bu yöntemlerin bir kombinasyonu gibi çeşitli şekillerde parçalanabilir. Yüksek protein verimlerinin toplanması için inklüzyon cisimlerinden saflaştırma önerilir.
- Ni-NTA kolon kromatografisi kullanarak proteinleri saflaştırın (bkz. Malzeme Tablosu). Çözünür fraksiyonu rejenere bir Ni-NTA boncuk sütununa (1 mL / dak) yükleyin. Bir gradyan başlatmadan (60 dakika boyunca TBS'de %0-100 500 mM imidazol) ve fraksiyonları toplamadan önce sistemi TBS tamponu (50 mM Tris, 150 mM sodyum klorür, pH 7.5) ile yıkayın. 100 mM PBS'ye karşı biyokimyasal karakterizasyon için saflaştırılmış proteinleri diyalize edin (Şekil 1C, D).
- Alternatif olarak, sırasıyla 20 mM imidazol ve 250 mM imidazol ile tampon çözeltilerde his etiketli rekombinant olarak eksprese edilen CV-N'yi bağlamak ve yeniden askıya almak için 14 mL'lik tüplerde His-Select Ni2 + afinite jeli (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. En az 30 dakika toplu olarak
inkübe edin
not: Bu yarı saflaştırılmış proteinleri, hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisinden 1-1.5 mL elüat yükleyebilen karbonhidratlar ve proteinler gibi biyolojik numunelerin tampon değişimi ve temizlenmesi için tek kullanımlık önceden paketlenmiş bir kolona uygulayın.
- Protein çözeltilerini 10 kDa'lık bir kesme filtresi ile santrifüj tüplerine aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları 4.500 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyerek konsantre edin. SPR ölçümleri için analit çözeltilerini 10 mM HEPES, 150 mM sodyum klorür, 3 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve %0,05 Tween20, pH 7.4 (HBS-EP (+), bkz.
- Bu SPR çalışan tamponu 1:10'luk bir seyreltme faktörüne ekleyin ve 4.500 x g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca ilk hacme dört kez santrifüjleyin.
- 23.474 Da'lık bir boyut gösteren ana protein CVN20,440 için hesaplanan sönme katsayısına (1 M-1 cm-1) dayalı olarak bir NanoDrop UV-Vis spektrofotometresi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak 280 nm'deki protein konsantrasyonunu belirleyin. PBS (100 mM, pH 7.0) veya SPR tamponunu boş olarak kullanın ve protein konsantrasyonunu üç seyreltme adımında (1: 1, 1:10 ve 1:100).
7. SPR spektroskopisi
- Rejenerasyon tamponu olarak çalışan tampon HBS-EP(+) ve 10 mM glisin HCl pH 1.5-1.6 ile Çift Kanallı SPR sistemini (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. Cihazı, gaz gidericiyi, otomatik numune alma cihazını ve pompayı açın ve tüm sistemi ddH20 ile 1 saat yıkayın. Kullanıma hazır çalışma tamponunu ayrı bir şişeye koyun.
- Dedektöre daldırma yağı damlatın ve ince bir altın filmle kaplanmış ve üst tarafında karboksimetil dekstran hidrojel ile işlevselleştirilmiş bir cam sensör çipini (Malzeme Tablosuna bakın) doğrudan üç portlu akış hücresinin altındaki dedektöre monte edin. Tutamağı aşağı çekerek ayarı düzeltin.
not: C19RBDHC30M orta yoğunlukta biyotinile şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs-2 RBD proteini içeren 200 nm streptavidin türevli karboksimetil dekstran hidrojel, önceden hareketsizleştirilmiş ligandı ile kullanıma hazır bir sensör çipidir.
8. CV-N'nin HA, S proteini ve RBD'ye bağlanması için SPR bağlanma testi
- Aşağıdaki adımları izleyerek proteinli ligandları sensör çiplerine hareketsiz hale getirin.
- Menü çubuğundaki Form'a tıklayarak bir çalıştırma tablosu açın ve entegre SPRAutoLink yazılımında Tablo Düzenleyiciyi Çalıştır'a tıklayın (bkz. Mevcut çalıştırma tabloları listesinden BASIC_Immobilization seçin ve üzerine tıklayın ve bilgisayar ekranındaki deneysel prosedürün adımlarını izleyin. Kullanılan ilgili Örnek Düzenleyici sağ üst köşede gösterilir.
- Daha fazla analiz için otomatik numune alma cihazına yerleştirilen iki rafın reaktif listesini doldurmak için Form bölümündeki Numune Seti Düzenleyicisi'ne tıklayın. Rafları ileri veya geri getirmek için menü çubuğundaki "Araç" olarak Otomatik Örnekleyici Doğrudan Kontrolü'ne tıklayın. Çalışma sıcaklığı olarak 4 °C'yi seçin.
not: SPR yazılımı, ilgili araçları seçerek ve ayrıca otomatik numune alma cihazı kullanarak ve Form'a tıklayarak "SPR Instrument Direct Control" ve "Pump Direct Control"e izin verir; ayrıca veri analizi yapmak için Tablo Düzenleyiciyi Çalıştır, Veri Grafiği veya İşlem Sonrası seçilebilir. Dosyalar doğrudan varsayılan dizine kaydedilir ve İşlem Sonrası penceresinden scrubber.files olarak dışa aktarılır.
- Araçlar ve Pompa Doğrudan Kontrolü'ne tıklayarak ddH20'ı infüze etmek için pompayı çalıştırın ve SPR Instrument Direct Control'e tıklayarak verileri kaydedin ve her seferinde yeni görünen pencerelerde Başlat'ı açın. Birleştirme reaktiflerini (adım 8.3) 300 μL'lik şişelere koyun, bunları otomatik numune alma raflarına koyun ve Run.
düğmesine tıklayarak çalışma tablosunu başlatın
not: Talaş yüzeyleri ya 10 mM glisin tamponu pH 9.0 ile şartlandırılır ya da EDC/NHS aktivasyon karışımı için karboksil türevlendirilmiş talaş yüzeyini koşullandırmak için 1 M sodyum klorür, 0.1 M sodyum borat tampon pH 9.0 ile yıkanmış olabilir.
- Bu basit protein-protein etkileşimi için, hareketsizleştirilmiş HA ile bir mikro kırılma indisi birimi (μRIU) = 2500 - 3000 akış hücresi ve spike proteinli μRIU = 400 akış hücresi oluşturmak için CMD500D çipini (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. 15 μL/dk'lık bir infüz akış hızında, 0.4 M N-etil-N'- (dimetilamino propil) karbodiimid hidroklorür (EDC*HCl) ve 0.1 M N-hidroksisüksinimid (NHS) sulu ve eşit bir karışım enjekte edin.
- Pompayı 25.000 μL/dk'da yeniden doldurun, 30 saniye boyunca taban çizgisi ayarı yapın, 6 dakikalık temas süresi boyunca 90 μL numune aktivasyon solüsyonu (EDC/NHS) enjekte edin ve ardından 5 dakika daha tutun.
- Kimyasal olarak sentezlenmiş peptitleri, HA'yı ve spike proteinini 20 μg / mL'de enjekte etmek ve hareketsiz hale getirmek için sadece sol akış hücresinde (mavi) 10 μL / dk'da 1 dakika boyunca taban çizgisi çalıştıktan sonra bu döngüyü tekrarlayın ve aktive edilmiş çip yüzeyini 1 M etanolamin HCl pH 8.5 ile söndürmeden önce ddH2O ile 1.5 dakika boyunca sonraki taban çizgisi ayarlamasına izin verin.
- HBS-EP(+) ile tüpleri sıvı numune alıcıdan ddH20'dan gaz gidericiye geçirin (Şekil 2).
- SPR sensör gramlarını analiz edin.
- Kinetik etütler yapmak için, her enjeksiyondan sonra bir rejenerasyon adımı ve farklı analitlerden sonra boş ölçümler ile çeşitli analit konsantrasyonları (10-5-10-8 M) kullanın. Akış hızını 10 μL/dk olarak değiştirin ve 4 dakikalık temas süresi, ardından 5 dakikalık temel oluşturma ve her biri 2 saniyelik 30 dakikalık iki rejenerasyon adımı için enjeksiyonlara başlayın.
- Farklı protein konsantrasyonlarını normalleştirmek için sensorgramları numune çalışmalarından çıkarılan boş ölçümler için tampon çözeltisini enjekte edin.
- Form'a tıklayın, aşağı kaydırın ve bu işlem moduna tıklayarak "İşlem Sonrası" olarak değiştirin. Her akış hücresi için Veri Grafiği Formunda zaman içinde oluşturulan bağlama eğrilerini seçmek için Ekle'ye tıklayın ve kaplamayı bir kaydırma aracı dosyası (.ovr) olarak dışa aktarın. Dosya kaydetme seçeneklerini açmak için Dosya'ya tıklayın. Sol ve sağ eğrileri hizalayarak ve ikinci referans kanalının sinyallerini ligand kanalınınkilerden çıkararak yanıt eğrileri elde edin.
not: Veriler, sensorgramların hesaplamalı olarak tanımlanması ile "İşlem Sonrası" olarak çalıştırılır. Sol ve sağ akış hücrelerinden bir sensorgram katmanına konur veya her iki kanalın farkından sensorgram olarak temsil edilir.
- Tuz veya herhangi bir protein kontaminasyonu izlerini gidermek için bağlama ölçümlerinden önce ve sonra 50-100 mM glisin tamponu pH 9.5, su ve %20 etanol ile tüm akışkanları temizleyin veya daha sıkı, %0.5 SDS ve glisin ile.
not: Cihazın hasar görmesini önlemek için, talaşlar bir tampon altında veya %100 nemde saklanmışsa, talaş kartuşunu cihaza yeniden takmadan önce cam çipin mekanik stabilitesini kontrol etmeniz önerilir.
Tablo 1: CVN2L0 ve Cys-Cys bağ varyantları V2, V4 ve V5'in bir Langmuir 1:1 bağlama modeli kullanılarak HA'ya bağlanması için SPR sensorgramlarından elde edilen kinetik veriler. KD [M] = kkapalı/kaçık veya kd/ka. Tüm veriler HBS-EP(+) tamponunda 25 °C'de üretilir.
Serisi
| Analit | küzerinde [M-1*s-1] | KKapalı [S-1] | KD |
| CVN2L0 | 5.1 e3 | 1.3 E-3 | 255 deniz mili |
| V2 Serisi | 4.0 B3 | 1.1 E-3 | 275 deniz mili |
| V4 Serisi | 1.2 e3 | 1.3 E-3 | 11 μM |
| V5 Serisi | 1.2 e3 | 5.8 E-2 | 5 μM |
