Atomik Düzeyde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Nükleer Manyetik Rezonans

Özet

Kaynak: Winkelaar, G., et al. Küresel ve Filamentli Proteinlerin Etkileşimlerinin Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ve Mikro Ölçekli Termoforez (MST) ile Ölçülmesi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, ¹⁵N etiketli vahşi tip ve mutant envoplakin proteini ile etiketlenmemiş vimentin proteini arasındaki protein-protein etkileşimlerini incelemek için nükleer manyetik rezonans spektroskopisi tekniğini açıklar. Yabani tip envoplakin ve vimentin arasındaki başarılı etkileşim, NMR spektrumlarında geniş çizgi genişlemesine ve tepe kaybolmasına yol açarken, mutasyona uğramış envoplakin ve vimentin arasında bir etkileşimin olmaması, NMR spektrumlarında iyi çözülmüş zirvelere neden olur.

Protokol

1. NMR Yöntemleri

1. NMR Numune Hazırlama
   1. 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 kullanarak ¹⁵N etiketli vahşi tip veya R1914E E-PRD proteinini saflaştırın. Protein stok çözeltileri genellikle yaklaşık 1 mL.
      hacimlerle 0.3 ila 1 mM arasında değişir. not: Protein, konsantrasyonu numune hazırlama için uygun bir aralığa getirmek için bir MWCO 3 kDa, 5 mL santrifüjlü ultrafiltrasyon cihazı kullanılarak >100 μM'ye konsantre edilebilir.
   2. 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 kullanarak etiketlenmemiş bir VimRod proteini örneğini saflaştırın.
   3. 500 μL'lik bir nihai hacimde, 100μM'lik bir nihai konsantrasyona vahşi tip veya mutant E-PRD proteini, %10'luk (h/h) nihai konsantrasyona döteryum oksit (D₂O) ve DSS (4,4-dimetil-4-silapentan-1-sülfonik asit) 20 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. 20 mM Tris-HCl kullanarak numune hacmini 500 μL'ye getirin, 1 mM DTT ve pH 7. Temsili numune hazırlama Tablo 1.
      'da açıklanmıştır. not: DSS'nin 0 ppm rezonansı, ¹H kimyasal kaymalarını kalibre etmek ve ayrıca proteinin ¹⁵N kimyasal kaymalarının dolaylı referansı için kullanılır. D₂O, spektrometrenin sabit bir net manyetik alanda çalışmasını sağlamak için döteryum kilit sinyali için kullanılır.
   4. Önceki adımda olduğu gibi ikinci bir E-PRD, D₂O ve DSS numunesi oluşturun ve hacmi 500 μL'ye çıkarmadan önce VimRod'u 50 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
   5. Deney için 500 μL'lik numuneleri 5 mm genişliğindeki NMR tüplerine aktarın.

2. NMR Deney Düzeneği

1. Çıkarma komutu "ej" ile hava akışını açın; bu, numuneyi mıknatıstan yukarı getirecektir. Şimdi, numuneyi mıknatısın açıklığının yanındaki bir döndürücünün içine yerleştirin ve "ij" komutuyla yerleştirin. Devam etmeden önce numune mıknatısın içine yerleşene kadar bekleyin.
2. "edc" komutunu kullanarak yeni bir veri kümesi oluşturun ve "ZGPR" deneyini seçerek standart ¹H NMR parametrelerini yükleyin (Şekil 1). NAME, EXPNO (deney numarası) ve PROCNO (işlenmiş veri klasörü numarası) alanlarını doldurun. "Çözücüyü ayarla" alanında çözücüyü seçin ve standart prob kafası ve çözücüye bağımlı (prosol) parametreleri okumak için "Execute 'getprosol'" düğmesine tıklayın.
3. "lock" komutunu kullanarak numuneyi döteryumlu çözücüye, yani D₂O'ya kilitleyin ve süpürme işlemi bitene ve kilitlenmeyi başarana kadar bekleyin.
4. "atma" otomatik ayarlama komutunu kullanarak numuneyi ayarlayarak mıknatısın rezonans frekansını düzeltin. Otomatik ayarlama tamamlanana kadar yalpalama eğrisini izleyin.
5. TOPSHIM kullanarak manyetik alanı şim yapın ("topshim" komutu). Shimming, numune etrafında homojenlik elde etmek için bir manyetik alana ayarlama işlemidir. Şim değerlerini "wsh" komutuyla saklamak ve aynı veya benzer örnekler kullanılıyorsa topshim'den önce "rsh" kullanarak okumak iyi bir uygulamadır.
6. Maksimum sinyal-gürültü oranı elde etmek için alıcı kazancını "rga" komutuyla ayarlayın.
7. Spektrumun merkezini su rezonans ofsetine (o1) yerleştirin ve 90 derecelik proton darbesini (p1) "calibo1p1" kullanarak yüksek güçte ayarlayın.
8. Sıfır go "zg" komutunu kullanarak proton spektrumunu toplayın ve üstel çarpma ("em"), çizgi genişletmeyi içeren serbest indüksiyon bozunması (FID), FID'nin "ft" Fourier dönüşümü ve faz düzeltmesini uygulamak için "pk" içeren "efp" ile işleyin.
9. Entegrasyon seçeneği olmadan polinomu kullanarak otomatik faz düzeltmesi "apk" ve otomatik taban çizgisi düzeltmesi "absn" uygulayın.
10. Deneyde "SFHMQC3GPPH" seçeneğini seçerek SOFAST HMQC deneyi için yeni bir veri kümesi (1.2.2'deki gibi) oluşturun.
11. Proton spektrumundan optimize edilmiş P1 ve O1'i kopyalayın ve "getprosol 1H p1 plw1" komutunu kullanarak P1'e bağımlı darbeleri doldurun, burada p1 optimize edilmiş P1 değeridir ve plw1, P1 için güç seviyesidir.
12. Amid, kimyasal kayma için ofseti ayarlamak için CNST54 sabitini ve alıcı kazancının optimize edilmesini sağlayan spektral ilgi bölgelerini kapsayacak şekilde bant genişliğini tanımlamak için CNST55'i optimize edin (Şekil 2). Bu parametreleri seçmek için, iki boyutlu spektrumdan ilk FID'yi (serbest indüksiyon bozunması) çıkarın ve bunları tanımlamak için gözlemlenen sinyali arayın. Ek olarak, go ve taramanın veri kalitesini gerçek zamanlı olarak izlemesini sağlayan "gs" komutuyla kabul edilebilir sinyal hassasiyeti elde etmek için gevşeme gecikmesini (D1), tarama sayısını (NS) ve sahte taramaları (DS) değiştirin.
13. Zero Go "zg" kullanarak spektrumları kaydedin.

Tablo 1. NMR Numune Hazırlama.

örnek	Tampon A'da 1 mM E-PRD (μL)	Tampon A'da 1mM VimRod1 (μL)	Tampon A (μL)	D2O'da 200 μM DSS (μL)	TamponB2 (μL)	Toplam Hacim (μL)
Tek başına E-PRD	50	0	50	50	350	500
E-PRD + VimRod	50	50	0	50	350	500
1Tampon A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
>2Tampon B: 23 mM Tris-HCl, 1.14 mM DTT, pH 7

Sonuçlar

Şekil 1: NMR deneyinin kurulumunun ekran görüntüsü. Gösterilen pencere, bir HSQC veri kümesi toplamak üzere standart bir deney ayarlamak için kullanılır. Deney parametreleri, Deney'in yanında okunur. Gösterilen ZGPR deneyi, standart ve çözücüye bağımlı proton parametrelerini yüklemek için bir ilk deney olarak seçilmiştir. Başlık penceresi, kayıt tutma amacıyla deneysel ayrıntıları girmek için kullanıl...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amonyum klorür (15N, %99)	Cambridge İzotop Laboratuvarları	NLM-467	NMR için izotop etiketleme
D2O, döteryum oksit (D, %99.8)	Cambridge İzotop Laboratuvarları	DLM-2259	NMR numune hazırlama
DSS, Sodyum 2,2-dimetil-2-silapentan-5-sülfonat-D6 (D,% 98)	Cambridge İzotop Laboratuvarları	DLM-8206	NMR için referans
Hassas 5 mm NMR Tüpler, 7" uzunluğunda	SJM / Deuterotüpler	BOROEKO-5-7	NMR tüpleri
NMR spektrometresi (14.1 Tesla)	Bruker		NMR verilerinin elde edilmesi
TCI 5mm z-PFG kriyojenik prob	Bruker		NMR verilerinin elde edilmesi
yazılım
Bruker TopSpin 4.0.1	Bruker		NMR verilerinin işlenmesi

Serisi Serisi Serisi