Bir Hedef Proteine Yüksek Afiniteye Sahip Proteinleri Seçmek için Faj Ekranını Kullanma

Özet

Kaynak: Zhang, W., et al., E3 Ligazları için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekranını Kullanma. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu videoda, hedef proteine yüksek afiniteye sahip proteinleri ifade eden önceden tasarlanmış fajları izole etmek için faj görüntüleme tekniğini gösteriyoruz.

Protokol

1. Faj kitaplığını hazırlayın

1. Faj kütüphanesini buz üzerinde çözün ve PBS'deki kütüphane çeşitliliğinin 100 katına kadar seyreltin. Örneğin, kitaplık çeşitliliği 1 x 10¹⁰ ve kitaplık konsantrasyonu 1 x 10¹³ ise, kitaplığı 1 x 10¹² olacak şekilde seyreltin. Burada kullanılan kütüphaneler için, kütüphanenin 1 mL'sini 9 mL PBS ile birleştirerek PBS'de 10 kat seyreltin.
   not: Kütüphane çeşitliliği, kütüphane oluşturulurken belirlenmelidir ve başka türlü kolayca değerlendirilemez. Kütüphane konsantrasyonu, E. coli hücrelerinin orta log fazında aşılanmasıyla (OD600 0.6 - 0.8) ve LB / karbonhidrat üzerine kaplama yapılarak belirlenebilir.
2. 1/5 hacim PEG/NaCl ekleyin. Örneğin, daha önce seyreltilmiş kitaplığın 10 mL'si için 2 mL PEG / NaCl ekleyin.
3. 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
4. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 11.000 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve kalan süpernatanı aşağı çekmek için 2 dakika yeniden santrifüjleyin.
   not: Tüpü, peleti aynı yerde tutan ilk kişi olduğu gibi ikinci kez rotora aynı yönde yerleştirin, bu nedenle görmeyi kolaylaştırın.
5. Faj peletini protein başına 1 mL PBT'de nazikçe yeniden süspanse edin. Dört protein için, peleti 4 mL PBT.
   içinde yeniden süspanse edin not: Peletlere dokunmamaya çalışın ve hava kabarcıkları sokmayın.

2. Hedef protein(ler)e faj gösterin

1. İsteğe bağlı kontrol: Kontrol plakasındaki kaplanmış her oyuğa 100 μL faj kitaplığı ekleyin. Oda sıcaklığında (~ 20-25 ° C) 300 rpm orbital çalkalama ile 1 saat inkübe edin ve kitaplığı kontrol plakasından hedef plakaya aktarın.
2. PB tamponunu hedef plakadan çıkarın ve kaplanmış her kuyucuğa 100 μL faj kütüphanesi ekleyin.
3. Oda sıcaklığında (~ 20-25 ° C) 300 rpm orbital çalkalama ile 1 saat inkübe edin.

3. Bir fajı yuvarlak olarak elute

edin

1. Faj kütüphanesini çıkarın ve kaplanmış kuyucukları PT tamponu ile dört kez yıkayın. Plakayı ters çevirin ve son damlaları çıkarmak için bir kağıt havluya hafifçe vurun.
   not: Bir plaka üzerinde birden fazla hedef protein kaplanırsa, kuyucuklar arasındaki sonraki tüm çözeltilerin akışını en aza indirmeye çalışın.
2. Kaplanmış her bir oyuğa 100 μL 0.1 M HCl ekleyin ve 300 rpm orbital çalkalama ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
3. Kaplanmış her oyuğa 12.5 μL 1 M Tris-HCl (pH 11) ekleyerek pH'ı nötralize edin.
4. 8 kuyucuğun tümünden alınan ayrıştırılmış fajı tek bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Çözeltileri homojen hale getirmek için aktarım sırasında yukarı ve aşağı pipetleyin ve kuyucuklardaki tüm sıvıyı aspire edin.
5. Havuzlanmış ayrıştırılmış faja% 1'lik bir nihai konsantrasyona% 10 BSA ekleyin. 950 μL'lik tipik bir yuvarlak elüsyon hacmi için 95 μL'lik BSA ekleyin. 4 °C'de saklayın. Bu birinci tur çıktıdır.

4. Sonraki seçim turları için hazırlık

1. Adım 1.1'de olduğu gibi bir sonraki seçim turu için faj girdisini kültürlemek için bir tohum kültürü hazırlayın.
2. Aşağıda belirtilen değişikliklerle adım 1.2'deki gibi üçüncü seçim turu için plakayı kaplayın.
   1. 96 oyuklu bir bağlama plakasında protein başına sadece dört kuyu kaplayın. Uygun tur için "yuvarlak 2/3" veya "yuvarlak 4/5" tüplerin içeriğinin yarısını kullanın. Proteinlerin çözeltiden dışarı çıkmasını önlemek için bu tüplerin içeriğini gerektiği gibi seyreltin.
3. Bir sonraki seçim turu için faj girişini hazırlayın.
   1. 3 mL orta log faz hücrelerini aşılamak için birinci tur çıkışın yarısını kullanın. Tipik bir yuvarlak birinci çıktı için, 500 μL çıkış ile aşılayın.
   2. 37 °C'de 200 rpm orbital sallama ile 30 dakika inkübe edin.
   3. M13K07 yardımcı fajını 1 x 10¹⁰ PFU/mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
   4. 37 °C'de 200 rpm orbital sallama ile 1 saat inkübe edin.
   5. 3 mL kültürün tamamını 30 mL 2YT/karbonhidrat/kan'a aktarın. 200 rpm orbital sarsıntı ile 37 °C'de gece boyunca büyütün.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Axygen Mini Tüp Sistemi (0,65 mL, steril, 96/Raf, 10 Raf/paket)	Balıkçı Bilimsel	14-222-198	Plastik eşya
BD Difco Susuz Kültür Ortamı: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Balıkçı Bilimsel	DF0446-17-3	Titre için plakaların hazırlanması
Sığır Serum Albümini (BSA), Fraksiyon V	BioShop Kanada	ALB001	Tampon bileşeni
Karbenisilin disodyum tuzu% 89.0-100.5 susuz	Millipore-Sigma	C1389-5G	Fagemid ile enfekte olmuş hücrelerin kültürlenmesi
Kompakt Dijital Mikroplaka Çalkalayıcı	Balıkçı Bilimsel	11-676-337	aygıt
Corning Mikroplaka Alüminyum Sızdırmazlık Bandı	Balıkçı Bilimsel	07-200-684	Faj gliserol stoklarının sızdırmazlığı
Susuz Agar	Balıkçı Bilimsel	DF0140-01-0	Titre için plakaların hazırlanması
DS-11 Spektrofotometre/Florometre	DeNovix Teknolojisi	DS-11 FX+	aygıt
Greiner Bio-One CellStar 96 kuyulu, işlem görmemiş, U şeklinde tabanlı mikroplaka	Balıkçı Bilimsel	7000133	Plastik eşya
hidroklorik asit	Balıkçı Bilimsel	A144-500	kimyasal
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Kimyasal Olarak Yetkin E. coli	Balıkçı Bilimsel	C854003	Faj enfeksiyonu için bakteri suşu
Kanamisin Sülfat	Balıkçı Bilimsel	AAJ1792406	M13K07 yardımcı faj ile enfekte olmuş hücrelerin kültürlenmesi
M13KO7 Yardımcı Faj	New England Biyolojik Laboratuvarları	N0315S	Phagemid paketleme ve salgısına izin verin
MaxQ 4000 Tezgah Üstü Orbital Çalkalayıcı	Balıkçı Bilimsel	11-676-076	aygıt
Nunc MaxiSorp 96 oyuklu mikroplaka, düz tabanlı	Yaşam Teknolojileri	44-2404-21	Plastik eşya
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) 10X Çözeltisi	Balıkçı Bilimsel	BP3994	Tampon bileşeni/faj yeniden süspansiyon ortamı
ELISA ve Kuluçka için Polyester Filmler	VWR (VWR)	60941-120	İnkübasyon sırasında mikroplakaların örtülmesi
Polietilen Glikol 8000 (PEG)	Balıkçı Bilimsel	BP233-1	Faj çökeltme
Sodyum klorür	Millipore-Sigma	S3014 Serisi	Faj çökeltme
Steril Plastik Kültür Tüpleri: Yarı Saydam Polipropilen	Balıkçı Bilimsel	14-956-1D	Faj girdilerinin kültürlenmesi
Tetrasiklin Hidroklorür	Balıkçı Bilimsel	BP912-100	E. coli OmniMax hücrelerinin kültürlenmesi
Tris Tabanı	Balıkçı Bilimsel	BP1525	Ayrıştırılmış faj çözeltisinin nötralize edilmesi
Tripton Tozu	Balıkçı Bilimsel	BP1421-2	Hücre büyüme ortamı bileşeni
Ara 20	Balıkçı Bilimsel	BP337500	Tampon bileşeni
Maya Özü	Balıkçı Bilimsel	BP1422-2	Hücre büyüme ortamı bileşeni