Protein Homo-Oligomerizasyonunu İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

1. FKBP12 F36V -mVenüs Arıtma

1. Monomerize insan FKBP12F36V12 ve N-terminal His6 ve mVenüs etiketleri içeren pET22b vektörü ile pLysS hücrelerini dönüştürün (DE3) (vektör istek üzerine temin edilebilir). 50 μg/mL Ampisilin ve 34 μg/mL Kloramfenikol ile takviye edilmiş LB agar üzerine plaka hücreleri.
2. Dönüştürülmüş kolonileri 100 mL LB başlangıç kültürüne aktarın ve çalkalama ile 37 ° C'de 16 - 20 saat büyütün.
3. Yoğun başlangıç kültürünü (OD600 >1) 1:100 LB ortamında (2 x 500 mL partiler) seyreltin ve 2 - 3 saat OD600 = 0,6 - 0,8'e (37 ° C, 200 rpm) kadar büyütün.
4. Buz üzerinde serin kültürler. 250 μM IPTG ile indükleyin ve 21 °C, 200 rpm'de 16 - 20 saat büyütün.
5. Hücreleri 20 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.
6. EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri (hücre peleti başına 1 tablet) ile desteklenmiş 40 mL IMAC tamponu A'da (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 3 mM imidazol, 1 mM β-merkaptoetanol) peleti yeniden süspanse edin.
7. Buz üzerinde hücreleri (500 Watt, 20 kHz,% 40 genlik,% 9 sn açık, 15 dakika boyunca 11 s kapalı) sonikat ve 20.000 x g'da santrifüjleme ile çözünür materyali hasat edin.
8. Çözünür lizatı konik bir şişeye aktarın ve 2 mL reçine ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). 105 rpm dönüş ile 1 saat inkübe edin
   not: Bu IMAC adımı için nikel sefaroz da kullanılabilir.
9. Reçineyi hasat edin ve 250 mL IMAC tamponu A ve ardından 500 mL IMAC tamponu B (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 7 mM imidazol, 1 mM β-merkaptoetanol) ile yıkayın.
   not: Nikel sefaroz reçinesi kullanılıyorsa 50 mM imidazole yükseltin.
10. IMAC tampon C (20 mM sodyum fosfat pH 7.5, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 1 mM β-merkaptoetanol) kullanarak His6 etiketli proteini elute edin.
11. 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl ve 1 mM DTT'de dengelenmiş bir boyut dışlama kolonuna (Malzeme Tablosuna bakınız) enjekte edin. FKBP12F36V, kullandığımız kolonda 87.71 mL'de tepe elüsyonuna sahiptir.
12. SDS-PAGE aracılığıyla saflığı değerlendirin ve gerektiği gibi havuzlayın ve konsantre edin.

2. Çok kuyulu plaka dizisinin hazırlanması

1. Saflaştırılmış FKBP12F36V (veya ilgilenilen etiketli proteini) -80 °C'den çözün.
2. 100 nM saflaştırılmış FKBP12F36V (orta, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) bir çözelti hazırlayın. Agrega oluşumunu önlemek için sonikat ve santrifüj (13.000 rpm'lik hızlı dönüş).
3. 100 - 200 μL'yi cam tabanlı 8 oyuklu bir gözlem odasına pipetleyin.
4. BB dimerizeratörü 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ve 500 nM'lik nihai konsantrasyonlara ekleyin.
5. Referans olarak, potansiyel toplama ve çökelme etkilerini değerlendirmek ve aynı edinme ayarlarıyla monomer için bir parlaklık değeri elde etmek için tek başına 100 nM mVenüs'lük bir çözelti hazırlayın.

3. Kalibrasyonsuz Konfokal Edinim

1. Konfokal sistemi başlatın (Şekil 1). Dijital dedektörler veya iyi karakterize edilmiş analog dedektörlerle donatılmış ve elde edilen her piksel için sabit bir bekleme süresi tutabilen herhangi bir ışık taramalı mikroskop konfokal sistemi işe yarayacaktır.
2. Uyarma ışını yolunu ayarlayın:
   1. 514 nm lazeri açın ve hedefin çıkışında (FKBP12F36V mVenüs için) 20 - 100 nW Güce ayarlayın.
   2. FCS için tasarlanmış 63X1.4NA objektifi veya yaka düzeltmeli suya daldırma objektifini seçin.
   3. Bir HyD, APD veya kalibre edilmiş PMT dedektörünü açın. Foton sayma yapabilen dedektörler tercih edilir, bu durumda olduğu gibi S, ofset ve_{σ 0}^2'nin hesaplanması gereksizdir.
   4. 520 - 560 nm arasında emisyon penceresini seçin
   5. İlgili emisyon ~1 nm için iğne deliğini 545 Airy ünitesine ayarlayın.
   6. Çekim modunu 16 x 16 piksel olarak ayarlayın
   7. Piksel bekleme süresini , t D >> T D >> t beklemesini karşılayacak şekilde ayarlayın, burada T_D difüzyon proteininin kalma süresi ve t_çerçevesi kare hızıdır. Bu, bekleme süresinin ~13 μs.
      olarak ayarlanmasına karşılık geldi not: Bazı ticari üreticilerin, piksel başına bekleme süresini sabit tutmayan tarayıcıları vardı. Bu sabitlik, yöntemin çalışması için çok önemlidir.
   8. Piksel boyutunu ~120 nm olarak ayarlayın.
   9. xyt alım modunu seçin ve alım ve kuyu başına alınacak çerçeve sayısını seçin (örneğin, 5.000).
   10. Sistem yüksek verimli bir modla donatılmışsa, süreci otomatikleştirmek için her bir kuyunun koordinatlarını ve kuyu başına satın alma sayısını tanıtın.
       not: Daldırma hedefi kullanıyorsanız bir su sebilinin varlığından emin olmaya dikkat edin.
   11. Sistem bir perfüzyon sistemi ile donatılmışsa, BB solüsyonunu yükleyin ve örneğin 10.000 görüntü elde ederken dimerizasyon kinetiğini değerlendirmek için perfüzyonu 5000^. kareden hemen sonra başlayacak şekilde programlayın.
3. FCS için tasarlanmış bir yaka düzeltme suya daldırma hedefi kullanıyorsanız, yağa daldırma hedefine/suya bir damla yağ ekleyin.
4. 8 kuyulu gözlem odasını sahneye monte edin.
5. Doğru kuyuyu seçin ve çözüme odaklanın.
   not: ÖNEMLİ: Yansıma ve saçılmayı önlemek için alt cama yakın odaklama yapmaktan kaçının. Çözümün derinliklerine odaklanırken, otomatik odak seçeneğinin bağlantısını kesin.
6. Alımı başlatın ve elde edilen görüntü yığınını TIFF biçiminde kaydedin.

4. R Paketi nandb kullanarak Detrend ve Parlaklık Analizi

Ön
1. işleme kalite kontrolü olarak, Şekil 2a'da gösterildiği gibi görüntülere bakmak ve yoğunluk profilini kurtarmak için ImageJ'yi kullanın. Bu, çok fazla foto ağartma olup olmadığını belirlemek için kullanışlıdır. Çok fazla beyazlatma varsa, veriler daha fazla analiz için uygun değildir.
   not: ImageJ, görüntüleri ticari biçimlerden TIFF'e dönüştürmek için de yararlı olabilir. Aşağıda açıklanan nandb yazılımı yalnızca TIFF dosyalarıyla çalışabilir.
2. R ve RStudio'yu indirin ve yükleyin. Önce R'yi, ardından RStudio.
   indirip yüklemek en iyisidir not: Aşağıda, nandb R paketinin nasıl kullanılacağına ilişkin bir açıklama yer almaktadır. Nandb'yi kullanmak için R dili bilgisi gerekli değildir, ancak hayatı kolaylaştıracaktır.
3. Nandb paketini yükleyin.
   1. RStudio'yu açın ve konsolda install.packages("nandb") yazın ve kurulumu bekleyin.
4. nandb'yi yakından tanıyın
   1. Kılavuzu gözden geçirin.
   2. Çeşitli işlevler için yerleşik RStudio yardımını gözden geçirin. Kullanılacak en olası fonksiyon brightness() olacaktır. Bu işlevin yardım dosyasını yazarak görüntüleyin ? parlaklık() konsolda.
5. Parlaklığı hesapla
   1. Diyelim ki masaüstünde img001.tif adlı bir görüntü dosyası var ('nandb'nin yalnızca TIFF dosyalarıyla çalıştığını unutmayın). Bu görüntünün parlaklığı hesaplanabilir:
      b <- parlaklık ("~ / Masaüstü / img001.tif", tau = "otomatik")
      1. Bu, görüntünün parlaklığını R'deki b değişkenine atar. tau = "otomatik", parlaklık hesaplamasından önce görüntünün doğru bir şekilde trendden çıkarılmasını sağlar. Buradan yapılacak en yaygın şey, görüntünün ortalama veya medyan parlaklığını hesaplamaktır. Bunu ortalama (b) veya medyan (b) yazarak yapabilirsiniz. Parlaklık görüntüsünü masaüstüne şu şekilde de yazabilirsiniz
         ijtiff::write_tif(b, "~/Masaüstü/whatever_img_name")
   2. Diyelim ki masaüstünde images_folder görüntülerle dolu bir klasör var ve birinin bu görüntülerin parlaklıklarını hesaplaması ve parlaklık görüntülerini TIFF dosyaları olarak yazması gerekiyor. Sonra bakınız ?brightness_folder(). Bu işlev, tüm klasörü bir kerede işler:
      brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "otomatik")
      Bu, özellikle R'yi tercih ettikleri yazılıma sahip olanlar için iyidir, çünkü tüm dosyalar tek bir komutta işlenir ve daha sonra ImageJ, Python veya başka bir şey olsun, seçtikleri yazılımda çıktı parlaklığı TIFF görüntüleriyle çalışmaya devam edilebilir.

Şekil 1. Çözeltideki protein monomer-dimer geçişlerini tespit etmek için N & B uygulaması. (a) Bir lazer kaynağı ile donatılmış bir lazer tarama mikroskobunun (LSM) basitleştirilmiş optik yolu (mVenüs etiketli proteinler durumunda 514 nm'ye ayarlanmış) bir daldırma hedefine (bizim durumumuzda 63X1.4NA yağı) yönlendirilmiş (mavi oklar) 100 nM'lik bir FKBP12F36V-mVenüs çözeltisi çözeltisini aydınlatır. Emisyon floresansı (yeşil oklar) dikroik bir aynadan geçer ve emisyon ışığını temizleyen bir bant geçiren filtreye ve foton sayma yeteneğine sahip bir nokta dijital dedektörünün hemen önünde yer alan 1 Airy ünitesinde ayarlanmış bir iğne deliğine yönlendirilir. (b) Gauss şekli konfokal hacmine giren ve çıkan tek FKBP12F36V mVenüs moleküllerini aydınlatan 16 x 16 piksel boyunca konfokal bir aydınlatma hacmi taranır ve bir dizi floresan yoğunluğu dalgalanması üretir. (c) Zaman içinde edinilen görüntü serileri

Şekil 2. Çözeltideki bir monomer popülasyonunu doğru bir şekilde ölçmek için otomatik trendi azaltma gereklidir. (a) Protokol bölümünde açıklandığı gibi 5000 adet 16 x 16 piksellik görüntü yığını elde edildi. İlk karenin yoğunluğu, ağartma ve diğer çözücü ve/veya fotofizik etkilerle ilişkili olabilecek uzun vadeli dalgalanmaları gösteren ortalama zamana bağlı yoğunluk profili ile birlikte gösterilir. Bu uzun vadeli dalgalanmaların nedeni ne olursa olsun, parlaklık hesaplamalarını etkilerler ve bu nedenle trendin kaldırılması gerekir. Otomatik trendden çıkarma olmadan, B = 1.026 elde edilirken, otomatik trendden çıkarmadan sonra B = 1.005 elde edilir. Ayrıca, (sol paneller, ikinci sıra) ve (sağ paneller, ikinci sıra) düzgün filtreleme olmadan parlaklık gösterilir. (b) (a)'da sunulan aynı veriler trendden çıkarılmış ve yoğunluk ve parlaklık açısından sonuçlar gösterilmiştir.