$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Klonlama
- Kopyalanacak yapılandırmaları belirleyin ve bir bağlayıcı seçin. Proteinleri, aşağıda tarif edildiği gibi N- veya C-terminalindeki fragmanlarla etiketleyin, böylece uygun lokalizasyonlarını bozmazlar. (GGGGS)x2 gibi esnek bir bağlayıcı kullanın.
- PAmCherry1 fragmanlarına ilgi duyulan proteinleri genetik olarak etiketleyin. Bir seçenek olarak, yan MCS dizileri ile RN (PAmCherry1 kalıntıları 1-159) ve RC (Met artı PAmCherry1 kalıntıları 160-236) fragmanlarını içeren Malzeme Listesinde listelenen klonlama plazmitlerini kullanın.
- RN ve RC fragmanlarını içeren plazmitleri, yerleştirme noktasında ters PCR (veya kısıtlama sindirimi) ile doğrusallaştırın. Ters PCR için primerler Tablo 1'de listelenmiştir. Aşağıda, yazarın laboratuvarında kullanılan örnek bir PCR protokolü verilmiştir (bu protokolde kullanılan tam malzemeler için Malzeme Listesine bakın).
- PCR reaksiyonunu birlikte karıştırın ve su ile 50 μl'lik bir son hacme getirin: ince duvarlı bir PCR tüpüne su, 25 μl 2x ana karışım, 0.5 μl ileri ve geri primerlerin her biri (20 μM seyreltilmiş stok, 0.2 μM nihai konsantrasyon) ve 1 ng şablon. Aşağıdaki döngü koşullarını kullanın: 30 saniye boyunca 98 °C, 7 saniye boyunca 98 °C'lik 30 döngü ve 2 dakika boyunca 68 °C ve 72 dakika boyunca son uzatma 10 dakika.
- PCR: RN ve RC fragmanları içeren doğrusallaştırılmış plazmitlere eklenmesi için ilgilenilen genler. PCR'yi adım 1.2.1'deki gibi uzatma süresi 68 °C'de olacak şekilde gerçekleştirin. (GGGGS)x2 için GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGGGAGGTAAGT ve rekombinasyon için doğrusallaştırılmış RN ve RC plazmitlerinin uçlarına 15 baz çifti homolojisi gibi esnek bir bağlayıcı dizisi içeren çıkıntılara sahip primerler kullanın.
not: Plazmit omurgasını doğrusallaştırmak için Tablo 1'deki primerler kullanılıyorsa, ilgilenilen proteinler için primer çıkıntıları Tablo 2'de sunulmuştur.
- PCR şablonunu ortadan kaldırmak için PCR reaksiyonunu Dpn1 ile sindirin. 0.5 μl Dpn1 (20 U/μl) doğrudan PCR reaksiyonunun 50 μl'sine ekleyin. 37 °C'de 1 saat inkübe edin ve 80 °C'de 20 dakika ısıyla inkübe edin. Arka plan şablonu sonraki adımlarda devam ederse, enzim miktarını artırın veya sindirim süresini uzatın.
- PCR ürünlerini, üretici tarafından açıklandığı gibi bir döndürme sütunu aracılığıyla saflaştırın.
- Bir RN veya RC fragmanı içeren doğrusallaştırılmış bir plazmiti ilgilenilen gen ile birleştirmek için ligasyondan bağımsız bir reaksiyon gerçekleştirin. Saflaştırılmış PCR ürünlerinin konsantrasyonunu ölçün: 50 ng doğrusallaştırılmış plazmid ve 50 ng ilgilenilen geni 1 μl enzim ön karışımı ile birleştirin ve toplam hacmi deiyonize su ile 5 μl'ye getirin. 50 ° C'de 15 dakika inkübe edin, buzun üzerine koyun ve 20 μl TE tamponu ekleyin.
- Rekombinant plazmitleri yetkin bakterilere dönüştürün.
- O/N kültürü için 2-4+ (istenildiği gibi) koloni seçin. 14 ml'lik polipropilen yuvarlak tabanlı bir tüpe 5 ml LB suyu ve 5 μl kanamisin (50 mg / ml stok) ekleyin ve seçilen bakteri kolonisini sterilize edilmiş bir aşılama halkası ile ekleyin. 225 rpm'de çalkalarken 37 °C O/N'de inkübe edin.
- Gliserol stoğu için 1 ml O/N kültürünü dondurun ve kalanını üretici tarafından tarif edildiği gibi mini hazırlayın.
- İyi bir klon belirlemek için sıralama yapın. Malzeme Listesindeki klonlama plazmitlerini kullanıyorsanız, füzyon yapısının tam dizisini elde etmek için gerektiği gibi M13 ileri ve geri primerleri (ayrı reaksiyonlarda) kullanın. Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi'nden (NCBI) BLAST gibi bir hizalama aracı kullanarak beklenen dizi ile karşılaştırın - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Dizi doğrulanmış yapıları bir rekombinaz reaksiyonu yoluyla bir ifade plazmidine aktarın.
- Geçici transfeksiyonlar için pcDNA veya lentiviral paketleme için pLenti gibi 75 ng hedef plazmit ve 1 μl enzim ön karışımına 50 ng rekombinant klonlama plazmidi ekleyin ve toplam hacmi deiyonize su ile 5 μl'ye getirin. 25 ° C'de 1 saat inkübe edin, ardından 5 μl TE tamponu ekleyin.
not: Lentiviral paketleme ve stabil hücre hattı üretimi için, her yapı için farklı bir hedef plazmit kullanın, örneğin biri puromisin dirençli ve diğeri neomisin ile. Bu, dönüştürülen hücrelerin çift seçimine izin verir. Ayrıca, yüksek ekspresyon seviyeleri için yapısal sitomegalovirüs (CMV) promotörü veya ayarlanabilir doksisiklin regüle ekspresyon için TetO operatörü ile CMV gibi her biri için promotörü göz önünde bulundurun.
- 5 μl'yi yetkin bakterilere dönüştürün ve plazmitleri 1.2.6 ila 1.2.8 adımlarında olduğu gibi, ancak uygun antibiyotik (tipik olarak ampisilin) kullanarak mini hazırlayın.
- En uygun BiFC yapılandırmasını belirleyin.
- Ekspresyon plazmitlerini U2OS hücrelerine (veya tercih edilen hücreye) birlikte transfekte edin.
- 8 oyuklu #1.5 cam tabanlı hazne slaytının her bir oyuğuna %10 FBS ile desteklenmiş 350 μl fenol kırmızısı içermeyen ve antibiyotik içermeyen DMEM ekleyin. Oyuk başına yaklaşık 7.5 x 104 hücre plakalayın, böylece hücreler ertesi gün yaklaşık% 70 -% 90 oranında birleşir.
- Kaplamadan sonraki gün, tercih edilen reaktifi kullanarak ve üretici tarafından tarif edildiği gibi her kuyucukta farklı konfigürasyonlara sahip ko-transfect ekspresyon plazmitleri.
- Her kuyucuk için, 0.6 ml'lik bir tüpte 50 μl serumsuz indirgenmiş ortama her bir ekspresyon plazmidinden 125 ng ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. 1 μl transfeksiyon reaktifini tüpün ortasından aşağıya ve doğrudan ortama ekleyin. Karıştırmak için hafifçe çalkalayın ve reaksiyonu 30 dakika bekletin.
- Hazne sürgüsünün her bir oyuğundaki ortamı yaklaşık yarı yarıya azaltın. Transfeksiyon karışımını damla damla kuyucuklara ekleyin ve karıştırmak için hafifçe çalkalayın. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24-48 saat inkübe edin. Transfeksiyondan sonraki gün medyayı değiştirin.
- Protokol 2'deki gibi bir floresan mikroskobunda görüntü hücreleri adım 2.1.4.
ile başlar
not: İfade seviyeleri yüksekse ve kamera PAmCherry1'in nispeten düşük foton çıkışı için yeterince hassassa, numune standart bir floresan mikroskobunda görüntülenebilir. Sulandırılmış PAmCherry1 molekülleri, yeşil uyarma (561 nm) filtre seti ile görüntülemeden önce bir ultraviyole filtre seti (405 nm) ile aktive edilebilir.
- Uygulanabilir olduğunda, örneğin, etkileşimi bozan ilgili proteinlerden birine bir nokta mutasyonu sokarak negatif bir kontrol oluşturun. Mutasyona uğratılacak proteinin ve seçilen konfigürasyonun klonlama plazmidi üzerinde bölgeye yönelik mutajenez gerçekleştirin.
- Yapıları viral partiküller halinde paketleyerek ve U2OS hücrelerini (veya tercih edilen hücre hattını) enfekte ederek kararlı bir hücre hattı oluşturun. İndüklenebilir (tetrasiklin) bir ekspresyon sistemi düşünün, böylece BiFC'nin uzun süreli geri dönüşümsüzlüğü bir sorunsa veya ayarlanabilir ekspresyon isteniyorsa, ekspresyon görüntülemeden önce indüklenebilir.
Dikkat: Virüslerle çalışmak Biyogüvenlik Seviyesi 2 olarak sınıflandırılır. Son nesil viral paketleme sistemleri, replikasyon yeteneğine sahip virüsler üretme olasılığını büyük ölçüde azaltmış olsa da, bazı riskler hala mevcuttur. Referanslar http://www.cdc.gov/ biosafety/publications/ adresinde bulunabilir.
- Bir lenti veya retroviral hedef vektör kullanarak adım 1.2.10'u tekrarlayın. Plazmitlerin daha fazla saflığı ve daha fazla saflığı için O/N kültürünü 100 ml'ye yükseltin.
- 1. Günde: Paketlenecek her yapı için yaklaşık 2 x 106 293T/17 hücreyi 10 cm'lik bir tabağa koyun.
- 2. Günde: Tercih edilen bir transfeksiyon reaktifi kullanarak ve üretici tarafından tarif edildiği gibi bir transfeksiyon reaksiyonu hazırlayın.
- Plazmid 1 ve 2'yi paketlemek için 250 ng/μl ve plazmid 3'ü steril suda paketlemek için 100 ng/μl nihai konsantrasyonlara sahip bir ambalaj plazmitleri ön karışımını hazırlayın. 5 ml'lik polipropilen yuvarlak tabanlı bir tüpte 1 ml serumsuz indirgenmiş ortama 10 μl ambalaj plazmidi ön karışımı ve 2,5 μg hedef plazmit ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüpün ortasından aşağıya ve doğrudan ortama 20 μl transfeksiyon reaktifi ekleyin.
- Karıştırmak için hafifçe çalkalayın ve RT'de 30 dakika inkübe edin. Ortamın yaklaşık yarısını hücrelerden çıkarın ve transfeksiyon karışımını damla damla ekleyin. Karıştırmak için hafifçe çalkalayın ve 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Sıcaklık ve CO2 dengesi için kapak gevşetilmiş bir tüpte plaka başına 10 ml ortamı inkübe edin.
- 3. Günde: Ortamı önceden inkübe edilmiş ortamla nazikçe değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri koyun. Kapağı gevşetilmiş olarak başka bir ortam tüpünü inkübe edin. Not: Sinsitya veya büyük çok çekirdekli hücrelerin oluşumu, ambalajın iyi gittiğinin bir işareti olabilir. Bununla birlikte, hücreler kırılgan bir durumdadır ve kolayca ayrılabilir. Ortamı değiştirirken, pipetleyiciyi yatay olacak şekilde eğin ve ortamı plakanın bir kenarına damla damla ekleyin.
- 4. Günde: Ortamı bir şırınga ile çıkararak ve 0,45 μm gözenek büyüklüğünde bir filtreden 50 ml'lik temiz bir tüpe süzerek virüsü hasat edin. Ortamı yavaşça önceden inkübe edilmiş ortamla değiştirin.
- 5. Günde: Daha önce adım 1.5.3.3'te yapıldığı gibi tekrar hasat edin ve ortak süzüntüyü aynı 50 ml'lik tüpte birleştirin. Her tüpe 6 ml virüs yoğunlaştırıcı ekleyin ve karıştırın. Virüs çökene kadar en az 24 saat 4 °C'de saklayın.
not: Hücrelerin sağlığına bağlı olarak, virüs üçüncü kez hasat edilebilir.
- Virüsü 4 ° C'de 15 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüjleyerek konsantre edin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 250 μl ortamda yeniden süspanse edin. Virüsler enfeksiyon için hemen kullanılabilir veya -80 ° C'de bir yıla kadar 50 μl'lik alikotlarda saklanabilir.
- Enfeksiyon için 6 oyuklu bir plakaya (oyuk başına% 10 FBS ile 2 ml DMEM) kuyucuk başına yaklaşık 3 x 105 U2OS (veya hedef) hücre plakası, böylece hücreler enfeksiyon sırasında yaklaşık% 50 birleşir.
- Ertesi gün, ortamın yaklaşık yarısını çıkarın, böylece yaklaşık 1 ml kalır. Her yapı için 50 μl konsantre virüs ile birlikte enfekte edin. Her oyuğa 1 μl polibren (8 mg / ml) ekleyin. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. Ertesi gün besiyerini değiştirin ve antibiyotik seçiminden önce bir gün daha inkübe edin.
not: Eklenecek virüs miktarı, istenen enfeksiyon oranına bağlı olarak değişebilir. Virüsler qRT-PCR kullanılarak titre edilebilir.
- Enfekte hücreleri seçmek için antibiyotik ekleyin. Seçimin etkinliğini test etmek için virüsü görmemiş enfekte olmamış hücrelere sahip ayrı kuyucuklar kanarya olarak gereklidir. 2-7 gün veya seçim tamamlanana kadar kuluçkaya yatırın.
not: Etkili konsantrasyonlar başlangıçta titre edilmelidir, ancak bunlar tipik olarak puromisin için 1.0 μg / ml ve neomisin için 1.0 mg / ml'dir.
- Hücreleri 10 cm'lik daha büyük bir tabağa genişletin ve Protokol 2'ye geçin.
2. Sabit Hücrelerin Görüntülenmesi
- Görüntüleme için bir örnek hazırlayın
- 8 oyuklu #1.5 cam tabanlı hazne sürgüsünü en az 1 saat boyunca 250 μl 1 M NaOH ekleyerek temizleyin ve PBS.
ile iyice yıkayın
not: İşlenmemiş oda kızakları tipik olarak yüksek arka plan sinyaline neden olur. Ek olarak, hücreler artık NaOH'ye karşı hassas olabilir ve cam yüzeyin iyice temizlenmemesi (10 kat yıkamaya kadar) hücre yapışmasını zorlaştırabilir. Gerekirse, yıkandıktan sonra temizlenmiş hazne sürgüsünü PBS O/N ile inkübe edin. Hassas hücre hatları için, daha yüksek bir yoğunlukta kaplama (örneğin, %50-%60 ilk birleşmede) yardımcı olabilir.
- % 10 FBS ile 350 μl fenol kırmızısı içermeyen DMEM'de oyuk başına U2OS kararlı ekspresyon hücrelerinin yaklaşık 5.5 x10 4'ünü plakalayın, böylece hücreler sağlıklı olur ve görüntüleme sırasında aşırı birleşmezler.
- Protein ekspresyonunu indüklemek için tetrasiklin eklemek gibi deney için gerekli tedavileri gerçekleştirin.
- Görüntülemeden hemen önce hücreleri düzeltin.
- Fiksasyondan önce, taze paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın -% 0.1 glutaraldehit (GA) ile 1x PME'de% 3.7 PFA. 10 ml PFA çözeltisi için 0.37 g PFA tartın ve 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 1 ml damıtılmış su ve 30 μl 1 M NaOH ve girdap ekleyin. 70 °C'de ısıtın ve PFA tamamen eriyene kadar her 1-2 dakikada bir girdap yapın.
- Çözünmüş PFA'yı 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın ve karıştırmak için 3.8 ml damıtılmış su, 5 ml 2x PHEM tamponu, 20 μl %25 glutaraldehit ve girdap ekleyin. Stok, 2x PHEM tamponu 120 mM BORU, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA ve 16 mMMgS04'tür ve pH 10 M KOH ile 7.0'a ayarlanmıştır. Bu fiksatif çözelti 4 °C'de birkaç gün saklanabilir.
Dikkat: PFA ve GA'nın her ikisi de tehlikelidir. Çözeltiyi bir çeker ocakta hazırlayın ve her iki kimyasalı da kullanırken uygun koruyucu ekipman kullanın. Solumaktan veya doğrudan cilt temasından kaçının.
- Büyüme ortamını çıkarın. 500 μl PBS ile hızlı bir şekilde yıkayın ve kuyucuk başına 250 μl PFA sabitleyici ekleyin. Hücreleri RT'de 20 dakika inkübe edin.
- PFA fiksatifini numuneden çıkarın ve kuyucuk başına 350 μl PBS veya görüntüleme tamponu (30 mM NaCl ve 20 mM MgCl2, pH 8.5 ile 100 mM Tris) ekleyin.
- Agregaları parçalamak için 100 nm altın parçacıklarını girdap haline getirin ve görüntüleme sırasında aşama kaymasını izlemek için oyuk başına 35 μl (10x nihai seyreltme) ekleyin.
- Görüntüleri elde edin
- Mikroskobu açın. 405 ve 561 nm lazerleri açın, ancak bu noktada panjurları (dahili veya harici) kapalı tutun. EMCCD kamerayı açın ve soğumasını bekleyin. 561 nm filtrelerin yerinde olduğundan emin olun.
- Alım yazılımını açın ve pozlama süresini 100 msn ve EMCCD kazancını 300 (aralık 1 – 1.000) olarak ayarlayın.
- Objektife daldırma yağı ekleyin ve numuneyi mikroskop aşamasına sabitleyin.
- Parlak bir alan veya 561 nm lazer açıkken (~1 kW/cm2 ), numuneyi odağa getirin.
- Ras ve diğer zar proteinlerini görüntülemek için, 1.49 sayısal açıklığa sahip 60X apokromat TIRF objektifi kullanın ve mikroskobu TIRF konfigürasyonuna getirin. Uyarma lazerini, TIRF objektifinin arka açıklığına çarparken merkez dışı olacak şekilde ayarlayın; Bu, lazerin numuneye ulaştığında sapmasına neden olur. Kritik açıya ulaşılana ve lazer geri yansıtılana kadar lazeri ayarlamaya devam edin. Görünümde birkaç altın parçacığı olan bir hücre arayın. Hücreyi (veya hücre içindeki bir bölgeyi) ve altın parçacıklarını çevreleyen bir ilgi alanı belirleyin.
Not: TIRF, uyarma lazerinin penetrasyon derinliğini azaltır ve odak dışı arka plan sinyalini azaltır. Ek olarak, daha fazla altın parçacığı göründüğünde sapma düzeltmesinin daha doğru olması muhtemeldir.
- Varsa, z yönündeki örnek kaymasını düzeltmek için otomatik odaklama sistemini devreye sokun. Aksi takdirde, görüntü odak dışına çıkarsa çekim boyunca odağı manuel olarak ayarlayın.
- Yeterli aktivasyonun halihazırda meydana gelmesi durumunda (tipik olarak ifade seviyeleri yüksekse) 405 nm lazer kapalı ve 561 nm lazer açık (~1 kW/cm2) ile edinime başlayın. Aksi takdirde, 405 nm lazeri en düşük fabrika güç ayarında (0,02 mW veya 0,01 W/cm2) açın ve çerçeve başına birkaç on molekül olana kadar veya tek moleküller iyi bir şekilde ayrılana kadar gerektiği kadar kademeli olarak (bir seferde 0,1 mW) artırın.
- Veri toplama devam ettikçe, nokta yoğunluğunu kabaca sabit tutmak için 405 nm lazer gücünü kademeli olarak artırın. Not: Daha düşük 405 nm uyarma gücünde, bazı PAmCherry1 zaten etkinleştirilebilir. Bu moleküller fotoağartıcı oldukça, kalan fotoaktive edilebilir PAmCherry1 moleküllerinin popülasyonu azalır ve her çerçevede floresan yayan moleküllerin aynı yoğunluğunu korumak için daha yüksek bir foton akısı gerektirir.
- Yüksek 405 nm güç (2,5 – 10 W/cm2) daha fazla etkinleştirme olayını etkinleştirmeyene kadar görüntü alımına devam edin.
not: Toplam alım süresi, ekspresyon seviyesine ve tamamlamanın verimliliğine bağlıdır.
Tablo 1. PAmCherry1 fragmanları içeren klonlama plazmitlerini doğrusallaştırmak için primerler. RN ve RC içeren klonlama plazmitleri, fragmanların N- veya C-terminalinde yerleştirme noktasında ters PCR ile doğrusallaştırılabilir. Diziler 5' ila 3' arasında listelenir.
| Astar dizisi (5' ila 3') |
| N-terminal tersine yerleştirme için plazmitin klonlanması | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| N-terminali ileri RN | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| N terminalinde RC ileri | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| İleri C-terminalinde yerleştirme için plazmitin klonlanması | TAAAAGGGTGGCGCGCC |
| C-terminalinden RN ters | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| C-terminalinden geri RC | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tablo 2. Tablo 1 primerleriyle eşleşen ilgilenilen gen primerleri için çıkıntılar.
Ligasyondan bağımsız reaksiyon için 15 baz homoloji çifti, astar çıkıntılarından üretilir. Ek olarak, çıkıntılar (GGGGS)x2 esnek bağlayıcı sırasını içerir. Esnek bağlayıcı dizisi bunun yerine Tablo 1'deki primerlere eklenebilir. Diziler 5' ila 3' arasında listelenir.
| İlgilenilen primer geni için çıkıntılar (5 'ila 3') |
| N-terminal yerleştirme RN veya RC ileri | GAGCTCGGTACCATG |
| N-terminal yerleştirme RN ters | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N-terminal yerleştirme RC ters | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C-terminal takılması RN ileri | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminal yerleştirme RC ileri | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-terminal takma RN veya RC ters | GCGCCCACCCTTTTA |