$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. SBDS-FlAsH'nin FlAsH Floresan Boya 4',5'-Bis (1,3,2 ditiyokarsolan-2-il) Floresein ile etiketlenmesi
- SBDS-FlAsH proteininin 3 nmol'ünü (FlAsH etiketi, rekombinant SBDS proteininin C-terminalinde genetik olarak tasarlanmış tetrasistein motifi Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys'e karşılık gelir) 3 nmol 4',5'-bis ile karıştırın (1,3,2 ditiyokarsolan-2-il) floresein boyası 5 μl hacimde Anizotropi tamponu (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, % 10 gliserol, 5 mM β-merkaptoetanol).
- Reaksiyonun 4 ° C'de 8 saat devam etmesine izin verin. Serbest boyayı çıkarmak için numuneyi gece boyunca Anizotropi tamponuna karşı diyalize edin.
- Etiketli proteinin yüzdesini ölçmek için Lambert-Beer yasasını kullanın. Uygun hacimde bir kuvars küvet kullanarak bir spektrofotometrede 280 nm ve 508 nm'de absorbansı ölçün. not: Aşağıdaki molar absorpsiyon katsayılarını (M-1 cm-1) göz önünde bulundurun:
Denklem 1
- Denklem 2.
kullanarak etiketli SBDS-FlAsH proteininin konsantrasyonunu hesaplayın
Denklem 2
- Önceki adımdan hesaplanan CSBDS-FlAsH'yi değiştirerek Denklem 3'ü kullanarak toplam SBDS proteininin konsantrasyonunu hesaplayın.
Denklem 3
- Denklem 4.
kullanarak etiketli proteinin yüzdesini hesaplayın
Denklem 4
2. Floresan Anizotropi Deneyleri
NOT: Anizotropi deneyleri, polarizasyon araç kutusu ile donatılmış bir spektroflorometrede yapıldı ve ekipmanın yazılımında sağlanan anizotropi programı kullanılarak veri toplama işlemi gerçekleştirildi. Uyarma dalga boyu, 8 nm'lik bir spektral bant genişliği ile 494 nm'ye ayarlandı ve emisyon, 530±25 nm'lik bir bant geçiren filtre kullanılarak kaydedildi. Ölçümler 25 °C'de 5 mm yol uzunluğuna sahip 200 μl'lik bir küvette yapıldı.
- Bir floresan küvetinde, 200 μl 30 nM SBDS-FlAsH'yi bir anizotropi tamponuna yerleştirin ve 2 μl 30 μM EFL1'i titre edin. İyice karıştırın ve anizotropi değerini ölçmeden önce reaksiyonun 3 dakika beklemesine izin verin.
- Toplam 40 μl EFL1 hacmi eklenene kadar adım 2.1'i tekrarlayın.
3. Veri Analizi
- Doğrusal olmayan en küçük kareler regresyon algoritması kullanarak verileri uygun bağlama modeline sığdırın. En yaygın bağlama modelleri için denklemler Tablo 1'de sunulmuştur.
- Uyum kalıntılarını inceleyerek proteinler arasındaki etkileşimi tanımlayan en iyi modeli değerlendirin. Seçilen modeli ek deneylerle destekleyin.
Tablo 1. Ortak protein-protein etkileşimi bağlanma modelleri ve bunları tanımlayan matematiksel denklemler.
