Transkripsiyon Faktörü-DNA Komplekslerinin Tespiti için Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi

Özet

Kaynak: Hsieh, YW et al., Kızılötesi Floresan Boya Etiketli Oligonükleotidler Kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için Optimize Edilmiş Bir Protokol. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, kızılötesi floresan etiketli DNA probları kullanarak protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için elektroforetik hareketlilik kaydırma testini gösteriyoruz. Protein DNA probuna bağlandığında, yavaşça hareket eden ve jel üzerinde kaymış bir bant olarak görünen büyük bir kompleks oluşturur.

Protokol

1. Bağlanma Reaksiyonu ve Elektroforez

1. 50 μL 1 M Tris-HCl, pH 7.5; 10 μL 5 M NaCl; 200 μL 1 M KCl, 5 μL 1 M MgCl₂, 10 μL 0.5 M EDTA, pH 8.0; 5 μL 1 M DTT; 25 μL 10 mg / mL BSA, ve 695 μL ddH₂O.
   not: 5x Bağlayıcı Tampon Tampon Ayrılabilir ve -20 °C'de saklanabilir. Dikkate alınması gereken bir diğer nokta, farklı transkripsiyon faktörlerinin bağlanma tamponunda farklı modifikasyonlara sahip olacağıdır.
2. Bağlanma reaksiyonlarını ayarlamadan hemen önce, 80 V'ta 30 - 60 dakika boyunca veya akım artık değişmeyene kadar tüm amonyum persülfat izlerini gidermek için %5 doğal poliakrilamid jeli 0,5x TBE + %2,5 gliserol içinde önceden çalıştırın.
3. Bağlanma reaksiyonunu 20 μL'lik son hacimde ayarlayın.
   1. 4 μL 5x bağlayıcı tampon, 80 - 200 ng saflaştırılmış protein A (% 50 gliserolde, yani SOX-2 içinde), 1 μL 0.1 μM Boya konjuge prob (son konsantrasyon: 5 nM) ve ddH₂O'yu karıştırın.
   2. İsteğe bağlı: Soğuk prob rakipleri gerektiğinde, çeşitli konsantrasyonlarda (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, vb.) soğuk problar ekleyin.
   3. İsteğe bağlı: Proteinler A ve B (yani, SOX-2 ve LIM-4) arasındaki etkileşim test edildiğinde, 80 - 200 ng saflaştırılmış protein B (% 50 gliserol, yani LIM-4) ekleyin.
   4. İsteğe bağlı: Nükleer ekstrakt preparatı kullanıldığında ve protein A'nın spesifik bağlanması doğrulanacaksa, protein A'ya özgü bir antikor ekleyin (yani, anti-6xHis, anti-FLAG, vb.).
   5. Karanlıkta R / T'de 15 dakika inkübe edin.
4. Tüm bağlanma reaksiyonlarını jel üzerine yükleyin ve jeli 10 V/cm'de istenen mesafeye kadar çalıştırın.

2. Görüntüleme

NOT: Jel, gelişmiş bir kızılötesi görüntüleme sistemi ile doğrudan cam plakalarda taranmıştır. Bu nedenle, jel daha fazla çözülebilir ve tekrar tekrar taranabilir (Şekil 1C ve 2). Jeli taramak için öncelikle Western blotları için yakın kızılötesi floresan görüntüleme sistemi de test edildi, ancak yalnızca gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi jeli iyi bir çözünürlükle tarayabildi. Açıklanan metodoloji belirli bir kızılötesi görüntüleme yazılımına özgüdür, ancak diğer yazılım paketleri de kullanılabilir.

1. Tarayıcının yatağını ddH₂O ile temizleyin ve taramadan önce iyice kurulayın. Jelin cam plakalarını silerek kurulayın ve jeli içeren plakaları tarayıcı yatağına yerleştirin.
2. Kızılötesi görüntüleme yazılımını açın ve 'Al' sekmesine gidin. İnceltici plaka (1 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 169 μm, Kalite: orta ve Netleme uzaklığı: 1,5 mm ayarlarını kullanın. Daha kalın plaka (3 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 84 μm, Kalite: orta ve Netleme uzaklığı: 3,5 mm ayarlarını kullanın. Odak ofseti, cam plakanın kalınlığına bağlıdır.
3. Jelin tarayıcıda kapladığı alanı seçin. Taramayı başlatmak için 'Başlat'a tıklayın.

Sonuçlar

Şekil 1. Kızılötesi Floresan Boya etiketli Oligonükleotidler kullanan fEMSA. (A) fEMSA'nın akış şeması. (B) Bromofenol mavisi boya, turuncu G ve dI-dC'nin (1 μg) fEMSA üzerindeki etkisi. 5 nM 5'Dye-LIM-4/SOX-2 probu kullanıldı. (C) 6xHis-SOX-2^G73E'nin LIM-4/SOX-2 elemanının SOX-2 hedef bölgesine bağlanma özgüllüğünü gösteren fEMSA. 5 nM 5'Dye-LIM-4/SOX-2 probu kullanıldı. L...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 30 Akrilamid/Bis Çözeltisi, 37.5:1	Biyo-Rad	1610158	Akrilamid zararlı ve toksiktir.
Sığır Serumu Albümini moleküler biyoloji sınıfı	New England Biyolojik Laboratuvarları	B9000S Serisi
5'IRDye700 etiketli DNA Oligoları	Entegre DNA Teknolojileri	Özel DNA oligo	Bunlar, el yazmasında 5'Boya etiketli veya kızılötesi floresan boya etiketli DNA oligoları olarak anılmaktadır. Şirket, 5' IRDye etiketli DNA oligonükleotidlerini özel olarak sentezleyecek. Minimum 100μM ölçek sentezi ve HPLC saflaştırması gerektirir.
Mini-PROTEAN Dikey Elektroforez Hücresi	Biyo-Rad	1658000FC	aygıt
Odyssey CLx Kızılötesi Görüntüleme Sistemi	LI-COR Biyoteknoloji	Odyssey CLx Kızılötesi Görüntüleme Sistemi	aygıt
Odyssey Fc Görüntüleme Sistemi	LI-COR Biyoteknoloji	Odyssey Fc Çift Modlu Görüntüleme Sistemi	aygıt
Image Studio yazılımı (sürüm 4.0)	LI-COR Biyoteknoloji	Image Studio yazılımı	yazılım
Turuncu G	Sigma-Aldrich	Ø3756-25G	kimyasal
6x Turuncu yükleme boyası			% 0.25 Turuncu G;% 30 Gliserol
0,5 kat daha			45 mM Tris-Borat; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8.0
1 adet STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Bağlama Tamponu			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 ug / ml BSA