Transkripsiyon Faktörü-DNA Komplekslerinin Tespiti için Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi

Özet

Kaynak: Hsieh, YW et al., Kızılötesi Floresan Boya Etiketli Oligonükleotidler Kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için Optimize Edilmiş Bir Protokol. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, kızılötesi floresan etiketli DNA probları kullanarak protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için elektroforetik hareketlilik kaydırma testini gösteriyoruz. Protein DNA probuna bağlandığında, yavaşça hareket eden ve jel üzerinde kaymış bir bant olarak görünen büyük bir kompleks oluşturur.

Protokol

1. Bağlanma Reaksiyonu ve Elektroforez

1. 50 μL 1 M Tris-HCl, pH 7.5; 10 μL 5 M NaCl; 200 μL 1 M KCl, 5 μL 1 M MgCl₂, 10 μL 0.5 M EDTA, pH 8.0; 5 μL 1 M DTT; 25 μL 10 mg / mL BSA, ve 695 μL ddH₂O.
   not: 5x Bağlayıcı Tampon Tampon Ayrılabilir ve -20 °C'de saklanabilir. Dikkate alınması gereken bir diğer nokta, farklı transkripsiyon faktörlerinin bağlanma tamponunda farklı modifikasyonlara sahip olacağıdır.
2. Bağlanma reaksiyonlarını ayarlamadan hemen önce, 80 V'ta 30 - 60 dakika boyunca veya akım artık değişmeyene kadar tüm amonyum persülfat izlerini gidermek için %5 doğal poliakrilamid jel....

Sonuçlar

Şekil 1. Kızılötesi Floresan Boya etiketli Oligonükleotidler kullanan fEMSA. (A) fEMSA'nın akış şeması. (B) Bromofenol mavisi boya, turuncu G ve dI-dC'nin (1 μg) fEMSA üzerindeki etkisi. 5 nM 5'Dye-LIM-4/SOX-2 probu kullanıldı. (C) 6xHis-SOX-2^G73E'nin LIM-4/SOX-2 elemanının SOX-2 hedef bölgesine bağlanma özgüllüğünü gösteren fEMSA. 5 nM 5'Dye-LIM-4/SOX-2 probu kullanıldı. L.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 30 Akrilamid/Bis Çözeltisi, 37.5:1	Biyo-Rad	1610158	Akrilamid zararlı ve toksiktir.
Sığır Serumu Albümini moleküler biyoloji sınıfı	New England Biyolojik Laboratuvarları	B9000S Serisi
5'IRDye700 etiketli DNA Oligoları	Entegre DNA Teknolojileri	Özel DNA oligo	Bunlar, el yazmasında 5'Boya etiketli veya kızılötesi floresan boya etiketli DNA oligoları olarak anılmaktadır. Şirket, 5' IRDye etiketli DNA oligonükleotidlerini özel olarak sentezleyecek. Minimum 100μM ölçek sentezi ve HPLC saflaştırması gerektirir.
Mini-PROTEAN Dikey Elektroforez Hücresi	Biyo-Rad	1658000FC	aygıt
Odyssey CLx Kızılötesi Görüntüleme Sistemi	LI-COR Biyoteknoloji	Odyssey CLx Kızılötesi Görüntüleme Sistemi	aygıt
Odyssey Fc Görüntüleme Sistemi	LI-COR Biyoteknoloji	Odyssey Fc Çift Modlu Görüntüleme Sistemi	aygıt
Image Studio yazılımı (sürüm 4.0)	LI-COR Biyoteknoloji	Image Studio yazılımı	yazılım
Turuncu G	Sigma-Aldrich	Ø3756-25G	kimyasal
6x Turuncu yükleme boyası			% 0.25 Turuncu G;% 30 Gliserol
0,5 kat daha			45 mM Tris-Borat; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8.0
1 adet STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Bağlama Tamponu			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 ug / ml BSA

Gazetesi fazla