Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Fare Beyninden PDGFRα Pozitif Oligodendrosit Soy Hücrelerinin Saflaştırılması (daha önce açıklanan immünopanning protokollerinden modifiye edilmiştir)
- PDGFRα pozitif hücre seçimi için bir immünopanning plakasının ve endotel hücrelerinin ve mikrogliaların tükenmesi için 2 plakanın hazırlanması.
not: Petri kaplarının ancak hücre kültürü kaplarının immünopanning deneyi için işe yaramadığını lütfen unutmayın; Saflaştırılmış hücreler kültürleme için kullanılacaksa, biyogüvenlik kabininde immünopanning adımları gerçekleştirilmelidir
- 10 cm'lik bir Petri plakasını 30 μL keçi sıçan önleyici IgG ile 10 mL pH 9.5, 50 mM Tris-HCl'de gece boyunca 4 ° C'de kaplayın. Plakaların yüzeylerinin kaplama çözeltisi ile eşit ve tamamen kaplandığından emin olmak için plakayı çalkalayın.
- 40 μL sıçan anti-PDGFRα antikorunu% 0.2 BSA içeren 12 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile seyrelterek PDGFRα antikor çözeltisini hazırlayın.
- Her biri 10 mL 1x DPBS olan IgG kaplı plakanın 3 yıkamasından sonra, IgG kaplı plakayı PDGFRα antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında 4 saat inkübe edin.
- Sıçan anti-PDGFRα antikor kaplı plakayı her biri 10 mL, 1x DPBS ile 3 kez yıkayın. DPBS solüsyonunu plakanın yan duvarı boyunca nazikçe ekleyin ve kaplanmış yüzeyleri rahatsız etmeyin.
- Endotel hücrelerinin ve mikrogliaların tükenmesi için 2 adet yeni 15 cm Petri plakasını 2.3 μg/mL Banderiaea simplicifolia lektin 1 (BSL-1) içeren 20 mL DPBS ile 2 saat boyunca kaplayın.
- BSL-1 kaplı plakaları 20 mL 1x DPBS ile 3 kez yıkayın. Plakaların yan duvarı boyunca DPBS solüsyonunu nazikçe ekleyin ve kaplanmış yüzeyleri rahatsız etmeyin.
- PDGFRα pozitif oligodendrosit soy hücrelerinin saflaştırılması, daha önce yayınlanmış yöntemlerden modifiye edilmiştir.
- Daha önce yayınlanmış protokollere göre doğum sonrası 2 gün 7 (P7) fare beyninden kortikal dokuları inceleyin.
- Ayrıntılı üreticinin talimatlarına göre bir nöral doku ayrışma Kiti (P) ile tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için dokuları ayırın.
- Kısaca disseke edilen kortikal dokuları neşter ile parçalara ayırın ve 37 °C'de enzimatik sindirime tabi tutun. Sindirimden sonra, parçaları Ateşle parlatılmış cam Pasteur pipetleri ile tek hücreli bir süspansiyona manuel olarak ayırın.
- Tek hücreli süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve 15 mL immünopanning tamponu kullanarak hücre peletini askıya alın (immünopan tamponu% 0.02 BSA ve% 5 μg / mL insülin ile DPBS'dir).
- Mikroglia ve endotel hücrelerinin daha iyi tükenmesini sağlamak için plakanın her 5 dakikada bir hafifçe çalkalanması ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2 BSL-1 kaplı plaka üzerinde 2 fare beyninden tek hücreli süspansiyonu sırayla inkübe edin.
- Hücre süspansiyonundaki yapışmayan hücreleri toplamak için plakayı hafifçe döndürün ve bunları oda sıcaklığında 45 dakika boyunca sıçan-PDGFRα antikor kaplı plaka üzerinde inkübe edin.
- Hücre süspansiyonunun sıçan-PDGFRα antikor kaplı plaka üzerinde inkübe edilmesinden sonra, hücre süspansiyonunu toplamak için plakayı hafifçe döndürün ve yapışmayan hücrelerden kurtulmak için plakayı DPBS ile 8 kez durulayın. Plakanın yan duvarı boyunca yavaşça yıkama solüsyonu ekleyin ve yapışmayan hücrelerden kurtulmak için plakayı birkaç kez çalkalayın.
- 37 ° C'de 10 dakika boyunca 4 mL hücre ayırma çözeltisi tedavisi kullanarak hücreleri sıçan-PDGFRα antikor kaplı plakadan ayırın. Yapışan hücreleri çıkarmak için plakayı sallayın.
- Saflaştırılmış OPC'leri oda sıcaklığında 300 x g'da santrifüjleme ile toplayın, hücre peletini 2 mL OPC hücre kültürü ortamı ile askıya alın ve hücreleri tripan mavisi ve bir hemositometre (5 mL penisilin-streptomisin çözeltisi (P / S), 5 mL N2, 10 mL B27 içeren DMEM / F12 ortamında 500 mL hücre kültürü ortamı, 5 μg/mL insülin, %0.1 BSA, 20 ng/mL bFGF ve 10 ng/mL PDGFRα).
- İmmünopanning sonrası OPC'lerin saflığının doğrulanması.
- İmmünopanningden sonra OPC'lerin zenginleştirilmesini değerlendirmek için, üreticinin talimatlarına göre guanidyum tiyosiyanat bazlı bir ekstraksiyon ile RNA ekstraksiyonu için saflaştırılmış OPC'lerin bir kısmını kullanın.
- Daha önce yayınlanmış materyallere göre ayrışmış beyin hücrelerine kıyasla saflaştırılmış OPC'lerde PDGFRα ekspresyonunun zenginleşmesini kontrol etmek için floresan yeşil boya ana karışımı kullanarak qRT-PCR gerçekleştirin.
- Ek olarak, daha önce yayınlanmış materyaller olarak anti-NG2 kondroitin sülfat proteoglikan (NG2) antikoru ile immünoboyama için Poli-D-Lizin kaplı 24 kuyucuklu plakalara bazı saflaştırılmış OPC'leri tohumlayın.
2. Yüksek Verimli Dizileme için Düşük Hücreli ChIP Hazırlığı ve ChIP Kitaplığı Oluşturma
- Olig2 Düşük hücreli ChIP hazırlığı, ticari olarak temin edilebilen bir sonikasyon sistemi ve ticari olarak temin edilebilen düşük hücreli bir ChIP kiti (üreticinin talimatlarındaki ayrıntılı standart prosedürleri izleyerek Malzeme Tablosuna bakınız).
- Sıçan anti-PDGFRα antikor kaplı plakadan ayrıldıktan ve tripan mavisi ve bir hemositometre ile hücre sayımından sonra, her ChIP reaksiyonu için 1 mL OPC hücre kültürü ortamına 20.000 saflaştırılmış OPC koyun.
- Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 10 dakika sabitlemek için 27 μL %36,5 formaldehit ekleyin.
Dikkat: Güvenlik nedeniyle kimyasal çeker ocakta formaldehit kullanılması gerektiğini lütfen unutmayın.
- 50 μL 2.5 M glisin ile DNA-protein çapraz bağlanmasını oda sıcaklığında 5 dakika boyunca durdurun.
not: Bu noktadan itibaren tüm adımlar buz üzerinde veya 4 °C soğuk odada gerçekleştirilmelidir.
- Çapraz bağlı hücre peletlerini proteaz inhibitörü kokteyli ile 1 mL buz gibi Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile yıkayın ve hücreleri 4 ° C'de 300 x g'da önceden soğutulmuş bir santrifüj ile peletleyin.
- Hücre peletini 25 μL'lik tam Lizis Tamponunda buz üzerinde 5 dakika boyunca parçalayın.
not: Lysis Buffer'daki hücreleri askıya almak için tüpü çalkalayın.
- Hücre lizatını proteaz inhibitörü kokteyli içeren 75 μL buz gibi HBSS ile destekleyin ve hücre lizatının kromatinini, 30 s AÇIK ve 30 s KAPALI programı ile 5 döngü önceden soğutulmuş sonikasyon sistemi ile kesin. Her zaman 6 tüpü birlikte sonikasyon yapın ve denge tüplerinin 100 μL su içerdiğinden emin olun.
- Kesme işleminden sonra, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin ve santrifüjlemeden sonra süpernatantı yeni bir tüpte toplayın.
- 100 μL kesilmiş kromatini, proteaz inhibitörü ile eşit hacimde buz gibi soğuk tam ChIP Tamponu ile seyreltin.
- Giriş kontrol numunesi olarak 20 μL seyreltilmiş kesilmiş kromatini kaydedin.
not: Olig2 antikoru immünopresipite DNA'yı tanımlamak için Olig2 immünopresipite edilmiş numune ile karşılaştırma olarak giriş kontrol numunesi de gereklidir.
- 180 μL seyreltilmiş kesilmiş kromatine 1 μL tavşan anti-olig2 antikoru ekleyin ve reaksiyon tüpünü 4 ° C'de 16 saat boyunca 40 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin.
not: Bu adımı soğuk bir odada gerçekleştirin.
- Her ChIP reaksiyonu için, 11 μL manyetik protein A kaplı boncukları 55 μL Boncuk Yıkama Tamponu ile yıkayın ve boncuk peletini 2 yıkamadan sonra 11 μL boncuk yıkama tamponuna koyun.
not: Bu adımı soğuk bir odada gerçekleştirin.
- Her ChIP reaksiyonu için, ChIP reaksiyon tüpüne 10 μL önceden yıkanmış Protein A kaplı boncuklar ekleyin. Bu adımı soğuk bir odada gerçekleştirin.
- ChIP reaksiyon tüpünü dönen bir tekerlek üzerinde 2 saat daha 4 °C'de inkübe edin.
- ChIP reaksiyon tüpünü 1 dk.
manyetik rafa koyun
not: Bu adımı soğuk bir odada gerçekleştirin.
- Süpernatanı çıkarın ve boncuk peletini yerinden çıkarmayın.
- Boncuk peletini 4 yıkama tamponunun her biri için sırasıyla 100 μL ile 4 °C'de dönen bir tekerlek üzerinde 4 dakika boyunca yıkayın.
- Yıkamalardan sonra, boncuk peletine 200 μL elüsyon tamponu ekleyin ve çapraz bağlı protein-DNA'yı tersine çevirmek için ChIP reaksiyon tüpünü 65 ° C'de 4 saat inkübe edin.
- Ek olarak, 20 μL Giriş kontrol örneğine 180 μL elüsyon tamponu ekleyin ve çapraz bağlı protein-DNA'yı da tersine çevirmek için 65 ° C'de 4 saat inkübe edin.
- Her bir ChIP reaksiyon tüpüne 200 μL 25:24:1 (h/h) fenol, kloroform ve izoamil alkol karışımı ekleyin.
- 1 dakika kuvvetlice vorteksleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin. Üst fazı yeni bir tüpe aktarın.
- Her bir ChIP reaksiyon tüpüne gece boyunca -20 °C'de 40 μL 3 M sodyum asetat çözeltisi, 1.000 μL %100 etanol ve mavi bir boyaya kovalent olarak bağlı 2 μL glikojen çökeltici ekleyin.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın, 500 μL soğuk %70 etanol ile yıkayın ve 13.000 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın, pelet havasını 10 dakika kuru tutun ve peleti 50 μL su ile çözün.
- Yüksek verimli dizileme için ChIP kitaplık yapısı
- ChIP DNA'yı üreticinin talimatlarına göre bir temizleme kiti ile temizleyin ve konsantre edin.
- ChIP numunesini üreticinin talimatlarına göre bir pico-green ile ölçün.
- Üreticinin talimatlarına göre T-tailing, replikasyon ve tailing, şablon değiştirme ve uzatma, adaptörlerin eklenmesi ve amplifikasyon, kitaplık boyutu seçimi ve saflaştırma için bir ChIP-seq kiti kullanın.
- DsDNA'nın denatürasyonundan sonra, ssDNA'nın 3' ucunu karides alkalin fosfataz ile defosforile edin ve terminal deoksinükleotidil transferaz ile ssDNA'ya bir poli (T) kuyruğu ekleyin.
- DNA replikasyonu ve şablon değiştirme için DNA Poli (dA) Primer'ı ssDNA şablonuna tavlayın.
- Şablon değiştirmeden sonra, indeksleme için ileri ve geri primerlerle ChIP-seq kitaplığını PCR ile yükseltin.
- Çift boy seçimi için seçenek 2'ye göre paramanyetik boncuklarla 250 ila 500 bp arasında değişen fragmanlara sahip PCR amplifiye ChIP-seq kitaplığını seçin.
- Bir mikroakışkan çip-kılcal elektroforez cihazı kullanarak seçilen ChIP-seq kitaplığının kalitesini inceleyin.
