1. Polarizasyon Mikroskobu
- Geniş alan lazer aydınlatması için, ışın temizleme için çok modlu optik fiberin açıklığına 638 nm'lik bir sürekli diyot lazer (40 mW) çizgisine odaklanın. Lazer ışığının polarizasyonunu ayarlamak için fiberin çıkışına doğrusal bir polarizör monte edin.
- Yayılan ışığın uyarma bileşenini bir dikroik ayna (640 nm kesme) ve bir bant geçiren filtre (bant geçiren 700/75) ile engelleyin.
- Floresan sinyalinin, yayılan ışığı dikey ve paralel polarize bileşenlerine ayıran polarize bir ışın ayırıcıdan geçmesine izin verin. Ardından, yansıyan ışını (paralel bileşen) ve yansıyan ışını (dikey bileşen) 200 mm odak uzaklığına sahip akromatik bir lens ile arkadan aydınlatmalı bir EM-CCD kameranın çipine odaklayın (Şekil 1b ve 1c). Merceğe doğru dik ışının yönünü ayarlamak için bir ayna kullanın.
2. Floresan Etiketli Referans DNA Oligomerinin Tasarımı ve Test Edilmesi
- Referans DNA'nın çekirdek dizisini belirleyin: yöntem, bir transkripsiyon faktörü ile TF'ye afinitesi referans olarak hareket eden floresan etiketli bir DNA ile bağlanma için rekabet eden etiketlenmemiş rakip DNA oligomeri arasındaki ayrışma sabitini (KD2) ölçen rekabetçi bir teste dayanmaktadır (KD1). DNaz ayak izi veya bakteriyel 1-hibrit gibi diğer kaynaklardan elde edilen konsensüs dizisi bir başlangıç noktası görevi görebilir.
not: Genel bir kural olarak, uygun bir referans DNA, konsensüs dizisine kıyasla TF'ye bağlanma afinitesinde 3 ila 7 kat azalmaya sahiptir.
- Önceki adımda türetilen konsensüs dizisinin 2-3 geçici tek mutasyonunun KD1s'sini HiP-FA ile ölçün. Bağlamanın tamamen kaybolmasını önlemek için çok spesifik olmayan konsensüs dizilerindeki pozisyonları mutasyona uğratmaya çalışın.
not: Referans dizisinin, ilgilenilen transkripsiyon faktörüne (bu protokolde Giant Gt kullandık) bağlı olması önemlidir, ancak çok güçlü olmamalıdır, böylece daha zayıf rakipler yüksek konsantrasyonlarda onu geride bırakabilir.
- Çekirdek motifini (genellikle 8-12 baz çifti), her iki tarafa simetrik olarak yan bir dizi ekleyerek (uygun ciltleme için yan zincirler ekleyin) 16 baz çifti veya daha fazla uzunluğa uzatın. Gerekirse (örneğin daha uzun bağlanma alanları için), daha uzun diziler kullanın (HiP-FA testi ile ~50'ye kadar baz çiftinin uzunluğu test edilmiştir).
Dikkat: Ektopik bağlanma bölgeleri oluşturması beklenen bazları eklememeye dikkat edin. Bu işlemi kolaylaştırmak için mevcut PWM'lerden bağlama bölgelerini tahmin eden hesaplama araçlarını kullanın (örneğin, PySite).
- Etiketli referans DNA olarak, 3' veya 5' ucunda ileri veya geri iplik üzerinde floresan olarak etiketlenmiş oligomerleri sipariş edin. Örneğin, Cy5, Bodipy-650 veya suda 10 μM (100 μM 10x stok) konsantrasyonda başka herhangi bir uygun boya kullanın ve adım 3.1'de açıklandığı gibi kademeli olarak seyreltin.
- Damıtılmış suya 33 mM potasyum fosfat tamponu (pH = 7.0), 90 mM NaCl ve% 0.01 iyonik olmayan deterjan ekleyerek 500 mL 1x bağlayıcı tampon hazırlayın. Ayrıca, üç kat konsantrasyonlar dışında aynı bileşenleri içeren 3x bağlama tamponu hazırlayın. 1x bağlama tamponu için stok çözeltisi olarak 3x bağlama tamponu kullanılıyorsa, 500 mL> hacimleri hazırlayın; aksi takdirde 250 mL.
hazırlayın
not: Bu bileşim, transkripsiyon faktörü stabilitesi ve glutatyon S-transferaz (GST) dimerizasyonunu önlemek için optimize edilmiştir.
- Adım 1'de açıklanan mikroskopi kurulumuyla, cam tabanlı mikroskopi 96 oyuklu bir plakada (farklı TF konsantrasyonlarına sahip 5-6 kuyucuk) farklı miktarlarda TF varlığında 0.8 nM etiketli referans DNA içeren 200 μL bağlayıcı tamponun FA'sını ölçün. Artan miktarlarda TF içeren bir titrasyon serisi gerçekleştirin ve test için eğrinin bir platoya ulaştığı konsantrasyonu seçin, bu da DNA referans oligomerinin tam bağlandığını gösterir.
not: Optimal TF konsantrasyonu, TF-DNA ayrışma sabitlerinin değerlerine bağlıdır. Genel olarak, daha düşükKD'lerdaha düşük konsantrasyonlar gerektirir.
3. Oligomer Tavlama
- Etiketli referans DNA'nın DNA oligomerlerini tavlamak için (önceki adımda belirlenen dizi), 7 μL 10 mM boya etiketli ileri tek sarmallı DNA çözeltisi ve 7 μL 10 mM konsantrasyonda etiketlenmemiş ters tamamlayıcısını 186 μL su içinde karıştırın.
- Rakip DNA dizileri için, ölçülecek her bir rakip dizi için 20 μL 100 mM ileri tek sarmallı DNA solüsyonunu (suda, üretici tarafından sağlanır) 20 μL 100 mM'lik karşılık gelen ters tek sarmallı DNA ile karıştırın.
- Çözeltileri 3 dakika boyunca 70 °C'ye ısıtarak ve sıcaklığı 0,1 K/s hızında RT'ye düşürerek standart bir PCR döngüleyicide tavlamayı ayrı olarak gerçekleştirin. Kullanılan PCR makinesi bu oranda sıcaklık gradyanlarını desteklemiyorsa, azalan sıcaklıklarla kademeli inkübasyonlar yapın (test edilen, döngü başına -0,4 K ile 3 s'lik 99 döngüdür).
4. Jel Hazırlama
>NOT: Aşağıdaki bölümde iki farklı jel türünün hazırlanması açıklanmaktadır: 1) titrasyon kuyuları proteinli jeller içerir ve ilgili rakip DNA dizileri içinKD'leribelirlemek için kullanılır ve 2) kalibrasyon kuyuları, her belirli zaman noktasında ve edinme yüksekliğinde DNA konsantrasyonunu belirlemek için NB'yi kullanır. Odak noktası, deneyin 96 oyuklu bir plakada hazırlanmasıdır, ancak 384 oyuklu bir plaka formatı için karşılık gelen hacimler de belirtilmiştir.
- Düşük erime noktalı agarozu bir laboratuvar mikrodalga fırınında kaynatarak bağlama tamponunda %0,5 w / v çözün. Tamamen çözündükten sonra, olası buharlaşmayı telafi etmek için hacmi ddH2O ile tekrar ayarlayın.
not: Kolaylık sağlamak için, jellerden 10-20 adet 10 mL'lik bir stok hazırlayın ve gerektiğinde 75 ° C'de eritin. Jel stokları RT.
adresinde saklanabilir.
Dikkat: Jel solüsyonunun mikrodalga fırında aşırı ısınmasını önlemek için dikkatli olun. Arada silkeleme ile kısa ısıtma zaman aralıkları tercih edilir.
- Titrasyon ve kalibrasyon kuyularını hazırlamak için önce iki adet 10 mL'lik jel stoğu alikotunu 75 °C'de çalkalayarak eritin.
- Her rakip için 240 μL (%20 ek yük dahil) kullanın (n = rakip dizisi sayısı).
- Her iki jelin eşit sıcaklık ve viskozitesini sağlamak için NB kalibrasyon kuyusu için aynı hacimde jel kullanın.
- Ardından sıcaklığı 35 °C'ye ayarlayın ve sıcaklığın dengelenmesini bekleyin.
- Titrasyon kuyucukları için, 1.4 nM (nihai konsantrasyon) hibritleştirilmiş referans DNA (adım 3'te elde edilir), TF proteini (son konsantrasyon CTF = 20-60 nM, adım 2.6'da belirlendiği gibi), DTT (0.2 mM) ekleyin ve 96 veya 384 oyuklu plaka formatında toplam n x 200 μL veya n x 13 μL hacimde bağlama tamponu, sırasıyla (artı ek yük). Ters çevirerek/çalkalayarak iyice karıştırın (girdap yapmayın).
- Önceki adımda hazırlanan jel çözeltisinin 96 oyuklu plaka formatında (386 kuyucuk için 13 μL/kuyucuk) kuyucuk başına 200 μL'yi kuyucuk plakasının titrasyon kuyularına yavaşça ekleyin.
- Kalibrasyon kuyuları için, önce kuyucukların dışındaki erimiş jele 5 nM NB ekleyin (kullanılan kuyu plakası formatına ve kalibrasyon kuyularının sayısına bağlı olarak toplam hacim; genellikle kuyu plakası başına 5-6 yeterlidir).
- 200 μL (384 oyuklu plaka formatı için 13 μL) NB içeren jeli kuyucuk plakasının titrasyon kuyularına yavaşça pipetleyin ve hava kabarcıklarını önlediğinizden emin olun.
not: Elektronik pipetlerin veya robotların kullanımı, tekrarlanabilirliği önemli ölçüde artırır.
- Jelin RT'de 10 dakika ve 10 °C'de 4 dakika daha katılaşmasına izin verin (gerekirse daha sonra camdaki yoğuşmayı giderin). Homojen olmayan jel yüzeylerini önlemek için tüm bu adımları mükemmel yatay bir yüzeyde uyguladığınızdan emin olun.
not: Protein içeren jeller genellikle 4 °C'de en az birkaç saat stabildir.
5. Rakip DNA Çözümünün Eklenmesi
NOT: Titrasyona başlamadan önce aşağıdaki çözeltiler hazırlanmalı ve kalibrasyon ve titrasyon kuyularının üzerine aynı anda eklenmelidir.
- Tavlanmış etiketli referans DNA'yı ve proteini, jel stoğu alikotlarından 3 kat daha yüksek konsantrasyonlarda 3x bağlayıcı tampona ekleyin.
- Elde edilen çözeltinin 20 μL'sini, 3. adımda elde edilen her bir tavlanmış rakip DNA çözeltisinin 40 μL'si ile karıştırın.
- Her kalibrasyon kuyusu için, 15 mM NB çözeltisi içeren 20 μL 3x bağlayıcı tamponu 40 μL tavlanmış rakip DNA ile karıştırın (aynı uzunluktaki herhangi bir dizi uygundur).
not: 384 oyuklu plakalar için toplamda 60 μL yerine 21 μL kullanın.
- İsteğe bağlı olarak, çok kuyulu bir plaka okuyucu kullanarak 380 nm'de absorbansı ölçerek plakanın farklı kuyucuklarındaki jel yükseklik seviyelerinin homojenliğini spektroskopik olarak kontrol edin (absorbans değerleri jel yükseklikleri ile orantılıdır).
- Jellerin üzerine 50 μL (384 oyuklu plaka formatı için 7 μL) karışık rakip DNA solüsyonlarından (adım 3'te tavlanmış) ekleyin. Elektronik çok kanallı pipetler veya varsa 96 kanallı pipetleme kafası kullanarak tüm rakip çözümleri mümkün olduğunca aynı anda eklemeye çalışın. Rakip solüsyonların eklenmesinden sonra, plakayı mikroskop tablasına yerleştirin ve ölçümlere hemen başlayın.
6. Görüntü Edinme
- Sıralı olarak z-yığınlarının zaman serilerini elde edin (örneğin, 12 düzlem ve 100-300 ms aydınlatma süresi kullanın). Herhangi bir polarizasyon yanlılığını ortadan kaldırmak için kuyu yüzeyine çok yakın (burada kullanılan plakalarla < ~1.4 μm) görüntü çekmekten kaçının.
- Etiketli referans DNA'nın TF'den tamamen ayrılmasına kadar 10-25 döngü ölçüm gerçekleştirin. Son noktaya, rakip DNA'nın bağlanma kinetiğine ve yayılmasına bağlı olarak tipik olarak 1-2 saat sonra ulaşılır.
