1. Sistem Hazırlığı
- Bağlanma bölgesi plazmitlerinin tasarımı
- Ciltleme yeri kasetini Şekil 1'de gösterildiği gibi tasarlayın. Her mini gen aşağıdaki parçaları içerir (5' ila 3'): Eagl kısıtlama bölgesi, kanamisin (Kan) direnç geninin 5' ucunun ∼40 bazı, pLac-Ara promotörü, ribozom bağlanma bölgesi (RBS), mCherry geninin AUG'si, bir ara parça (δ), bir RBP bağlanma bölgesi, mCherry geninin 5' ucunun 80 bazı, ve bir ApaLI kısıtlama sitesi.
not: Testin başarı oranını artırmak için, her bağlama bölgesi için en az bir, iki ve üç bazdan oluşan ara parçalarla üç bağlama bölgesi kaseti tasarlayın. Daha fazla yönerge için Temsili Sonuçlar bölümüne bakın.
- Bağlanma bölgesi plazmitlerinin klonlanması
- Bağlanma yeri kasetlerini çift sarmallı DNA (dsDNA) minigenleri olarak sipariş edin. Her minigen ∼500 bp uzunluğundadır ve sırasıyla 5' ve 3' uçlarda bir Eagl kısıtlama bölgesi ve bir ApaLI kısıtlama bölgesi içerir (bkz. adım 1.1.1).
not: Bu deneyde, pozitif kolonilerin taranmasını kolaylaştırmak için kanamisin geninin yarısına sahip mini genler sipariş edildi. Bununla birlikte, Gibson düzeneği burada da uygundur, bu durumda bağlanma bölgesi iki kısa tamamlayıcı tek sarmallı DNA oligosu olarak sipariş edilebilir.
- Kısıtlama protokolü ile hem mini genleri hem de hedef vektörü Eagl-HF ve ApaLI ile iki kez sindirin ve sütun saflaştırın.
- Sindirilmiş minigenleri, mCherry raportör geninin geri kalanını, sonlandırıcıyı ve bir kanamisin direnç genini içeren bağlanma bölgesi omurgasına bağlayın.
- Ligasyon solüsyonunu Escherichia coli TOP10 hücrelerine dönüştürün.
- Sanger dizilemesi ile pozitif dönüştürücüleri tanımlayın.
- İlgilenilen bölgeye 100 baz yukarı akışta bir astar tasarlayın (astar dizileri için Tablo 1'e bakınız).
- Birkaç bakteri kolonisini mini hazırlayın.
- 80 ng / μL konsantrasyonda 5 μL 5 mM primer çözeltisi ve 10 μL DNA hazırlayın.
- İki çözümü Sanger dizilimi için uygun bir tesise gönderin.
- Saflaştırılmış plazmitleri -20 °C'de ve bakteri suşlarını gliserol stokları olarak her ikisi de 96 oyuklu formatta saklayın. DNA daha sonra dört füzyon-RBP plazmitinden birini içeren E. coli TOP10 hücrelerine dönüşüm için kullanılacaktır (bkz. adım 1.3.5).
- RBP plazmid
tasarımı ve yapımı
NOT: Bu çalışmada kullanılan kaplama proteinlerinin amino asit ve nükleotid dizileri Tablo 2'de listelenmiştir.
- Uçlarda kısıtlama bölgeleri olan bir durdurma kodonu olmayan özel olarak sipariş edilmiş bir dsDNA mini geni olarak bir durdurma kodonu olmayan gerekli RBP dizisini sipariş edin (Şekil 1).
- Adım 1.2.2-1.2.4'e benzer şekilde, indüklenebilir bir promotörün hemen aşağısında ve başlangıç kodonu olmayan bir floresan proteinin yukarı akışında bir durdurma kodonu olmayan test edilmiş RBP'yi klonlayın (Şekil 1). RBP plazmidinin, bağlanma bölgesi plazmidinden farklı bir antibiyotik direnç geni içerdiğinden emin olun.
- Adım 1.2.5'e benzer şekilde Sanger dizilemesi yoluyla pozitif transformatörleri tanımlayın (primer dizileri için Tablo 1'e bakınız).
- Bir pozitif dönüştürücü seçin ve onu kimyasal olarak yetkin hale getirin. 96 oyuklu plakalarda -20 ° C'de gliserol saflaştırılmış plazmitler ve -80 ° C'de bakteri suşlarının gliserol stokları olarak saklayın.
- 96 oyuklu plakalarda depolanan bağlanma bölgesi plazmitlerini (adım 1.2.6'dan itibaren) halihazırda bir RBP-mCerulean plazmidi içeren kimyasal olarak yetkin bakteri hücrelerine dönüştürün. Zaman kazanmak için, hücreleri Petri kaplarına kaplamak yerine, ilgili antibiyotiklerle (Kan ve Amp) Luria-Bertani (LB) agar içeren 8 şeritli plakalar üzerinde 8 kanallı bir pipetleyici kullanarak plakalayın. Koloniler 16 saat içinde ortaya çıkmalıdır.
- Her çift dönüştürücü için tek bir koloni seçin ve ilgili antibiyotiklerle (Kan ve Amp) LB ortamında gece boyunca büyütün ve 96 oyuklu plakalarda -80 ° C'de gliserol stokları olarak saklayın.
2. Deney Düzeneği
NOT: Burada sunulan protokol, bir inkübatör ve bir plaka okuyucu ile birlikte bir sıvı işleme robotik sistemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her ölçüm, her bir suş + indükleyici kombinasyonu için iki kopya olmak üzere 24 indükleyici konsantrasyonu için gerçekleştirildi. Bu robotik sistem kullanılarak, 24 indükleyici konsantrasyonu ile günde 16 suş için veri toplandı. Bununla birlikte, böyle bir cihaz mevcut değilse veya daha az deney gerekliyse, bunlar 8 kanallı bir çoklu pipet kullanılarak ve protokolü buna göre uyarlayarak elle kolayca yapılabilir. Örneğin, 12 indükleyici konsantrasyonu ve dört zaman noktası ile günde dört suş için ön sonuçlar bu şekilde elde edildi.
- 0.5 g tripton, 0.3 mL gliserol, 5.8 g NaCl, 50 mL 1 M MgS4, 1 mL 10x fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu pH 7.4 ve 950 mL çift damıtılmış su (DDW) karıştırarak 1 L biyotahlil tamponu (BA) hazırlayın. BA tamponunu otoklav veya steril filtreleyin.
- 37 ° C'de ve 250 rpm'de çift dönüştürücü suşları uygun antibiyotiklerle (25 μg / mL nihai konsantrasyonda kanamisin ve 100 μg / mL nihai konsantrasyonda ampisilin) 1.5 mL LB'de çalkalayarak, 48 oyuklu plakalarda, 18 saatlik bir süre boyunca (gece boyunca).
- Sabahları aşağıdaki hazırlıkları yapın.
- İndüktör plakası. Temiz 96 oyuklu bir plakada, 37 ° C'de inkübatörde% 95 BA ve% 5 LB26'dan oluşan yarı fakir orta (SPM) içeren kuyular hazırlayın. Kuyu sayısı, istenen indükleyici konsantrasyon sayısına karşılık gelir. En yüksek indükleyici konsantrasyonunu (218 nM) içerecek olan indükleyici plakasındaki kuyucuklara C4-HSL ekleyin.
- Robotu, en yüksek konsantrasyonlu kuyucukların her birinden ortamı 0 ila 218 nM arasında değişen 23 düşük konsantrasyona seri olarak seyreltecek şekilde programlayın. Her bir indükleyici seyreltmesinin hacmi, tüm suşlar (kopyalar dahil) için yeterli olmalıdır.
- İndükleyici seyreltmeleri hazırlanırken, 180 μL SPM'yi inkübatörde 37 °C'de, 96 oyuklu plakalarda ısıtın.
- Gece boyunca suşları adım 2.2'den itibaren seri seyreltmelerle 100 faktör ile seyreltin: ilk olarak, 100 μL bakteriyi 48 oyuklu plakalarda 900 μL SPM ile karıştırarak 10 faktörü ile seyreltin ve daha sonra seyreltilmiş çözeltiden 20 μL alarak 180 μL önceden ısıtılmış SPM'ye 10 faktör ile tekrar seyreltin, floresan ölçümleri için uygun 96 oyuklu plakalarda.
- Seyreltilmiş indükleyiciyi, indükleyici plakadan, nihai konsantrasyonlara göre seyreltilmiş suşlarla birlikte 96 oyuklu plakalara ekleyin.
- Her 30 dakikada bir bir plaka okuyucu aracılığıyla 595 nm (OD595), mCherry (560 nm/612 nm) ve mCerulean (460 nm/510 nm) floresan optik yoğunluk ölçümleri alırken 96 oyuklu plakaları 37 °C'de 6 saat çalkalayın. Normalleştirme amacıyla, hücre eklenmeden SMP'nin büyümesini ölçün.
