1. 9. Gün (sabah): Enzimatik ölçüm için kültüre başlayın.
- Kültürü yeniden askıya alın ve bir spektrofotometre plakası üzerinde çok kanallı bir pipet kullanarak 125 μL aktarın (OD600'ü ölçün).
not: Dikkat: Kabarcıkları önlemek için son damlayı dağıtmayın, OD600 0,3 - 0,6'nın altındaysa, okumaya bağlı olarak kalan hücreleri 1-2 saat daha inkübe edin. Bu adımda kullanılan 125 μL'lik kültür, kullanıcının takdirine bağlı olarak atılabilir veya orijinal derin kuyu bloğuna geri aktarılabilir.
- Derin kuyu bloğunda kalan hücreleri 3000 x g ve 21 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı ters çevirerek çıkarın.
- 200 μL Z-tamponu ekleyin ve vortex.
not: Lütfen Tablo 1'deki Z-tampon tarifine bakın.
- 3000 x g ve 21 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı ters çevirerek çıkarın.
- 20 μL Z-tamponu ve girdap ekleyin.
- Plakayı donma-çözülme döngülerine dayanabilecek sızdırmazlık folyosu ile örtün. Çeker ocakta sıvı nitrojen kullanarak 4 döngü donma/çözülme ve ardından bir su banyosunda 42 ºC (her biri 2 dakika) gerçekleştirin.
- 200 μL Z-tampon / beta-merkaptoetanol (β-ME) / Orto-nitrofenil-β-galaktozit (ONPG) ekleyin (sırasıyla 12 mL, 21 μL, 8.4 mg 20 mL çözelti verecektir; her zaman taze hazırlayın).
not: ONPG'nin düzgün bir şekilde çözünmesi biraz zaman alacaktır, bu nedenle bu adıma ulaşmadan bir saat önce çözeltiyi hazırlayın. ONPG, β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümü için substrat görevi görür.
- 30 ° C'de 17 - 24 saate kadar inkübe edin (aradaki kontrolü kontrol edin, renk daha erken gelişirse bir sonraki adıma geçin).
2. 10. Gün (sabah): Reaksiyonu durdurun ve ölçün.
- Reaksiyonu durdurmak ve zamanı kaydetmek için 110 μL 1M Na2CO3 ekleyin.
- 3000 x g ve 21 ° C'de 10 dakika boyunca vorteks ve santrifüjleyin.
- Çok kanallı kullanarak 125 μL süpernatan alın ve OD420.
ölçün
not: Dikkat, kabarcıkları önlemek için son damlayı dağıtmayın.
Tablo 1: Protokolde kullanılan çözümlerin tarifi. Tablo, tahlilde kullanılan ana tamponların stok ve çalışma çözeltilerinin tarifini sağlar.
| TE tamponu 10X (10ml) | |
| Arzu | Stoktan |
| 1000mM Tris-Cl (pH 8.0) | 1 mL Tris 1M |
| 10mM EDTA (pH 8.0) | 200uL EDTA 0.5M |
| Hacmi su ile telafi edin | |
| TE/LiAc (10ml) | |
| Arzu | Stoktan |
| 1 katı | 1 mL TE 10X |
| 0,1 milyon LiAc | 1 mL LiAc 1M |
| Hacmi su ile telafi edin | |
| TE/LiAc/PEG (50 mL) %50 | |
| Arzu | Stoktan |
| 1 katı | 5 mL TE 10X |
| 0,1 milyon LiAc | 5 mL LiAc 1M |
| 40 mL PEG3350 | |
| Z-tamponu (1L) pH 7.0 | |
| Na2HPO4 16.1g heptahidrat veya 8.52g susuz |
| NaH2PO4 5.5 g hidratlı veya 4 g susuz |
| KCl 0.75g |
| MgSO4 0.246 g hidratlı veya 0.12 g susuz |
| HCl ile pH'ı koruyun |
| Tüm solüsyonlar kullanılmadan önce sterilize edilir. |
| Protokolde kullanılan besiyeri ve agar plakları (YPDA, SD-Ura; SD-Trp-Ura ve SD-Trp-Ura agar plakaları) Y1H'deki ile aynı tarifi takip edin |
