1. Protein hazırlama
- MOV10 ifade yapıları
- Fare MOV10'u kodlayan cDNA ifade yapıları oluşturun.
- Her parça için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) reaksiyonlarını ayarlayın. 1 μL fare cDNA'sı (C57BL / 6 fare testisinden), 1 μL dNTP, 2 μL 10 μM ileri primer, 2 μL 10 μM ters primer, 1 μL DNA polimeraz, 25 μL 2x PCR tamponu ve 18 μL çift damıtılmış H2O (ddH2O) 50 μL.
not: Mov10 gen fragmanlarının amplifikasyonu için primerler Tablo 1'de listelenmiştir.
- Aşağıdaki programları kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirin: 5 dakika boyunca 95 °C, 15 saniye boyunca 95 °C'de 35 döngü ısıtma, 64 °C'de 15 saniye tavlama, 72 °C'de 20 saniye uzatma (tam uzunlukta MOV2 uzatmak için 10 dakika) ve son uzatma 68 °C'de 7 dakika.
- Amplifiye edilmiş PCR DNA'sını jel elektroforezi ile analiz edin, gerekli boyuttaki bandı jelden bir UV lambası altında hızlı bir şekilde kesin ve bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
not: MOV10 için agaroz jel üzerinde görünen beklenen ürün boyutu 3015 bp'dir.
- PCR DNA'sını, üreticinin protokolünü takip ederek bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın.
- Adım 1.1.2'den itibaren santrifüj tüpüne eşit hacimde çözündürücü tampon ekleyin ve jeli 50-55 °C'lik bir su banyosunda 5-10 dakika eriterek jel parçalarının tamamen erimesini sağlayın. Tüpün duvarından herhangi bir damlacık toplamak için kısa bir süre santrifüjleyin.
not: Jelin ve çözünen tamponun kütle/hacim konsantrasyonu 1 mg/μL'dir.
- Adsorpsiyon kolonunu toplama tüpüne yerleştirin, çözünmüş jel parçasını içeren çözeltiyi adsorpsiyon kolonuna aktarın ve 2 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
- Toplama tüplerinin altındaki süzüntüyü atın. Kolona 600 μL yıkama tamponu ekleyin, 12.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin ve süzüntüyü atın.
- Adım 1.1.3.3'ü bir kez tekrarlayın.
- Sütunu tekrar toplama tüpüne yerleştirin ve kalan tüm yıkama tamponunu çıkarmak için 2 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
- Adsorpsiyon kolonunu 1.5 mL sterilize edilmiş bir santrifüj tüpüne yerleştirin, adsorpsiyon kolonunun ortasına 50 μL ddH2Oekleyin ve 1 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin. Bir spektrofotometre kullanarak elüatın DNA konsantrasyonunu ölçün.
- Plazmitlerin kısıtlama sindirimi
- 4 μg pRK5 vektörü, 5 μL 10x sindirim tamponu, 1 μL BamHI ve 1 μL XhoI ve ddH2O'yu 50 μL'lik bir nihai reaksiyon hacmine karıştırarak pRK5 vektörünü BamHI ve XhoI ile sindirin. 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
- Vektör DNA'yı jel elektroforezi ile analiz edin, bir UV lambası altında bir neşter ile jelden istenen boyutta bandı hızlı bir şekilde kesin ve bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
- Vektör DNA'yı, üreticinin talimatlarını izleyerek 1.1.3 olarak bir jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın.
- 0.03 pmol doğrusallaştırılmış vektör, 0.06 pmol cDNA fragmanı, 2 μL ligaz ve 4 μL 5x ligaz tamponu ve ddH 2O'yu 10 μL.
'lik bir son reaksiyon hacminde birleştirerek standart birrekombinant ligasyon reaksiyonu oluşturun
not: MOV10'u bir pRK5 vektörüne klonlayın.
- Karışımı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin ve ardından reaksiyonu hemen 5 dakika buz üzerinde soğutun. MOV10 rekombinant plazmitlerini DH5α bakterilerine dönüştürün.
not: Sanger sıralaması ile tüm rekombinant yapıları doğrulayın.
- Sıvı kültürlere eşit hacimde% 50 gliserol ekleyerek ve -80 ° C'de depolayarak, doğrulanmış rekombinant plazmitler içeren bakteri kültürlerinin gliserol stoklarını hazırlayın.
not: Sonraki her deney için, gliserol stoklarından bakterileri taze bir agar plakasına dökün ve adım 1.2'de açıklandığı gibi genişleme için tek bir koloni kullanın.
- HEK293T hücrelerinden MOV10 protein ekstraktları
- Kültürlenmiş HEK293T hücrelerinde MOV10 proteinlerini geçici olarak eksprese eder.
- MOV10-pRK5 plazmitini >500 ng/μL) konsantrasyonda hazırlayın.
- 15 cm'lik tabaklarda tohum HEK293T hücreleri. Hücre yoğunluğu ~% 70 -% 90'a ulaştığında, hücre kültürü ortamını% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren taze Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile değiştirin.
- Bir transfeksiyon için, 60 μg MOV10-pRK5 plazmit DNA'sını 3 mL indirgenmiş serum ortamında seyreltin, ardından 120 μL transfeksiyon arttırıcı reaktif ekleyin ve iyice karıştırın.
- Ayrı bir tüpte, 90 μL transfeksiyon reaktifini 3 mL indirgenmiş serum ortamı (penisilin-streptomisin olmadan) ile seyreltin ve iyice karıştırın.
- Seyreltilmiş DNA'yı, seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin her bir tüpüne ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Transfeksiyon karışımını hücre kültürüne ekleyin ve hücreleri ~ 36-48 saat boyunca kültürleyin.
- 36-48 saat sonra, her plakadan hücreleri 50 mL'lik bir tüpte toplayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Her peleti 10 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın ve hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
- Pelet, tam etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli içeren 3 mL hücre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Lizatı 20.000 x g ve 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyin.
- 1,5 mL'lik bir tüpteki hücre tabağı başına 100 μL anti-FLAG manyetik boncuk ekleyin.
- Manyetik boncukları 2x K150 tamponu ile yıkayın (pH 7.5'te 50 mM HEPE, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, %0.1 NP-40).
- Manyetik boncukları 1 mL buz gibi K150 tamponunda yeniden süspanse edin.
- Manyetik boncukları 4 ° C'de 2 dakika boyunca hafif dönüşle inkübe edin ve manyetik boncukları bir mıknatıs yardımıyla peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve atın.
- Manyetik boncukları adım 1.3.3'ten itibaren hücre lizat süpernatantına ekleyin ve 4 ° C'de 2 saat inkübe edin.
- Proteine bağlı manyetik boncukları 3 kez K150 tamponu ile, ardından 2 adet 250 mM NaCl içeren K150 ile, daha sonra 3 kez K150 tamponu ile 1.3.5 olarak yıkayın.
- Boncukları 300 μL FLAG elüsyon tamponunda (pH 7.5'te 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol) yeniden süspanse edin, FLAG peptidini 0.5 μg / μL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin ve 1 saat boyunca 4 ° C'de bir döndürücü üzerinde boncuklarla inkübe edin, ardından manyetik boncukları bir mıknatıs yardımıyla peletleyin.
- Ayrıştırılmış MOV10 proteinlerini içeren süpernatanı toplayın, konsantrasyonu belirleyin ve ileride kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
2. Nükleik asit hazırlama
- Biyotin etiketli veya etiketsiz DNA ve RNA oligonükleotidlerini (oligolar) uygun bir kaynaktan satın alın. Her bir oligo'yu RNaz içermeyen ddH2O ila 20 μM içinde seyreltin ve ileride kullanmak üzere -80 ° C'de tutun.
not: Bu çalışmada kullanılan DNA/RNA substratlarının oligo dizileri Tablo 2'de listelenmiştir.
- MOV10 helikaz aktivite deneyi için çift sarmallı RNA (dsRNA) tavlama reaksiyonu için aşağıdaki karışımı hazırlayın: pH 7.5, 6 mM KCl, 0.2 mMMgCl2'de 60 mM N-2-hidroksietilpiperazin-N-etan-sülfonik asit (HEPES) ve RNaz içermeyen ddH 2O'da 20 μL'lik bir son reaksiyon hacminde.
- Tavlama RNA oligoları, biyotin etiketli üst ipliğin (2 μM, nihai konsantrasyon) ve etiketlenmemiş tamamlayıcı alt ipliğin 1.5 katının bir karışımını tavlama tamponunda (adım 2.2) 95 °C'de 5 dakika ısıtarak RNA dupleksi oluşturur ve ardından yavaşça oda sıcaklığına (RT) soğutun.
3. İn vitro biyokimyasal testler
- EMSA ve enzimatik reaksiyonlar
- MOV10 helikaz aktivite deneyi için, pH 7.5'te 50 mM Tris-HCl, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, %0.01 NP-40, 1 mM DTT, 2 U/μL RNaz inhibitörü, 10 nM biyotin etiketli RNA substratı, 2 mM adenosin trifosfat (ATP), 100 nM RNA tuzağı ve 20 ng MOV10 proteini ve ddH2O'da 20 μL'lik bir son reaksiyon hacminde karıştırın. Reaksiyon karışımını 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin, 30 dk ve 60 dk. Reaksiyonu durdurmak için 5x durdurma arabelleğini ekleyin.
not: RNA tuzağı, diziye sahip biyotin etiketlenmemiş bir oligo olan RNA tuzağı, çözülmüş dsRNA'nın tekrar tavlanmasını önleyen etiketli oligoya tamamlayıcıdır.
- Poliakrilamid jeller
- Jel plakaları (16 cm x 16 cm) ve 1,5 mm tarakları yıkayın. Jel elektroforez ünitelerini monte edin.
- %10 doğal poliakrilamid jel hazırlamak için 14 mL ddH2O, 1.25 mL 10x Tris-borik asit-EDTA (TBE), 8.3 mL %30 akrilamid, 1.25 mL %50 gliserol, 187.5 μL %10 taze hazırlanmış amonyum persülfat (APS) ve 12.5 μL tetrametiletilendiamin (TEMED).
- % 20 doğal poliakrilamid jel hazırlamak için 5.5 mL ddH2O, 1.25 mL 10x TBE, 1.25 mL %50 gliserol, 16.7 mL %30 akrilamid, 187.5 μL %10 APS ve 12.5 μL TEMED.
- Akrilamid solüsyonunu hemen jelin içine dökün ve tarağı yerleştirin. Karışımın yaklaşık 30 dakika polimerize olmasına izin verin.
- Jel koşu
- Tarağı çıkarın ve tankları elektroforez çalıştırma tamponu (0.5x TBE) ile doldurun.
- Numune kuyucuklarını 0,5x TBE tamponu ile durulayın, ardından jeli 100 V'ta buz üzerinde 30 dakika önceden çalıştırın. Çalışan tamponu yeni 0,5x TBE ile değiştirin.
- Her kuyucuğa 20-25 μL numune yükleyin.
- EMSA tahlili için %10 doğal akrilamid jel ve enzimatik tahliller için %20 doğal akrilamid jel kullanın. Bromofenol mavisi işaretleyici jelin alt çeyreğine geçene kadar buz banyosunda 100 V'ta elektroforez çalıştırın.
- Jel plakalarını sökün ve yükleme kuyularını ve kullanılmayan şeritleri çıkararak jeli düzeltin. Jeli 0.5x TBE tamponuna yerleştirin.
- Filtre kağıdını ve naylon zarı jelin boyutuna göre kesin. Temiz filtre kağıdını ve naylon zarı önceden ıslatın.
- Aktarım için yığını birleştirin.
- Önceden ıslatılmış membranı önceden ıslatılmış filtre kağıdına yerleştirin.
- Jeli zarın üzerine yerleştirin.
- Jeli başka bir kat önceden ıslatılmış filtre kağıdı ile örtün.
- Temiz bir pipeti merkezden kenara yuvarlayarak tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
- Numuneleri jelden zara 90 mA'da 20 dakika boyunca yarı kuru bir elektroforetik aparat içinde aktarın.
- Aktarımı durdurun ve ardından membranı yeni bir filtre kağıdı üzerinde 1 dakika kurutun.
- 254 nm ampullerle donatılmış bir UV ışığı çapraz bağlayıcıda (otomatik çapraz bağlama işlevi) membranı 45-60 s boyunca 120 mJ/cm2'de ışınlayarak numuneleri çapraz bağlayın. Membranı RT'de 30 dakika havayla kurutun.
- Kemilüminesans tespiti
- Protokol 1: Standart hacimde ticari kemilüminesan nükleik asit tespit kiti kullanın.
- Membrana 20 mL bloke edici tampon ekleyin ve 20-25 rpm'de bir döndürücü üzerinde hafifçe çalkalayarak 15-30 dakika inkübe edin.
- 20 mL bloke edici tampona 66.7 μL stabilize streptavidin-yaban turpu peroksidaz konjugatı ekleyerek konjugat/bloke edici tampon çözeltisi hazırlayın.
- Engelleme tamponunu yavaşça çıkarın ve eşlenik/engelleme tamponu ile değiştirin. 20-25 rpm'de bir döndürücü üzerinde 15 dakika inkübe edin.
- Membranı 4x'i 40-45 rpm'de her biri 5 dakika çalkalanarak yıkayın.
- Membrana 30 mL substrat dengeleme tamponu ekleyin. Membranı 20-25 rpm'de çalkalayarak 5 dakika inkübe edin.
- 6 mL stabil peroksit çözeltisine 6 mL luminol / arttırıcı çözelti ekleyerek substrat çalışma çözeltisini hazırlayın. Işıktan kaçının.
- Membranın tüm yüzeyini alt tabaka çalışma solüsyonu ile kaplayın ve 5 dakika inkübe edin.
- Membranı kemilüminesan görüntüleme sisteminde 1-3 saniye tarayın.
Tablo 1: PCR'yi Meiob ve Mov10'un gen fragmanlarını amplifiye etmek için kullanılan primerler.İleri ve geri astarlardaki kalın harfler BamHI ve NotI kesme bölgeleridir; ters astardaki italik kalın harfler XhoI kesme siteleridir; kutulardaki kalın harfler, R235A nokta mutasyonuna karşılık gelen nükleotidleri gösterir.
| Parça | Astar | Diziler (5' ila 3' arası) |
| MEIOB-A | iletmek | CGGGATCCATGTTACTTTTTTTGATACACTTGCC |
| ters | ATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG |
| MEIOB-C | iletmek | CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA |
| ters | CGATGCGGCCGCCTCTTTATTTTCTCTTATATAATTCAGTAG |
| MEIOB-E | iletmek | CCGCGTGGATCCATGTTACTTTTTTTGATACACTTGCC |
| ters | CGATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG |
| MEIOB-E-mut | iletmek | CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC |
| ters | GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG |
| MOV10 | iletmek | GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC |
| ters | GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG |
Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan DNA/RNA substratlarının dizileri.
5'-Biotin-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU
| Rakamlar için | Ad -larını | Diziler (5' ila 3' arası) |
| Şekil 2, 5 | 36 nt ssDNA | 5'-Biotin-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3' (DNA) |
| Şekil 3 | 36 nt ssRNA | |
| Şekil 4 | 54 nt 5' kuyruklu dsRNA | 5'-Biotin-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (RNA)
5'-ACGAGGGAGACGGAGCGACGGCAGCGGU-3' (RNA) |
