DNA Onarım Protein Etkileşimlerinin İmmünofloresan Tabanlı Görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: de la Peña Avalos, B., et al., DNA Onarım Proteinleri Etkileşiminin İmmünofloresan ile Görselleştirilmesi. J. Vis. Exp. (2020).

Bu videoda, ışınlanmış hücre çekirdeğindeki çift sarmallı DNA kırılma bölgelerinde DNA onarım proteinleri γH2AX ve 53BP1'in lokalizasyonunu görselleştirmek için immünofloresan yöntemini açıklıyoruz.

Protokol

1. Nükleer ekstraksiyon ve hücre fiksasyonu

1. Stok çözeltileri hazırlayın: 0,2 M BORULAR (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M sükroz, 1 M MgCl₂, 0.1 M EGTA (pH 8.0).
2. Nükleer ekstraksiyon tamponu (NEB) hazırlayın: 10 mM BORULAR (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM sükroz, 3 mM MgCl₂, 1 mM EGTA (pH 8.0) ve% 0.5 (h / h) Triton X-100'ü ddH₂O'da çözün. Tamamen eriyene kadar karıştırın.
3. % 4 (h / h) paraformaldehit (PFA) hazırlayın: 10 mL %16 PFA sulu çözeltisini 30 mL PBS'de çözün. Tamamen eriyene kadar karıştırın.
4. Uygun zaman noktasında (t = 0, 1, 2, 4, 16 saat), hücreleri 1 mL PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi tamamen kaldırın.
5. Hücre çekirdeği ekstraksiyonu için her oyuğa 200 μL NEB ekleyin (sitoplazma bozulur, sadece çekirdek kalır) (Şekil 1). Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin ve tamamen çıkarın.
   not: 2 dakikayı aşmayın.
6. Hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın. PBS'yi tamamen kaldırın. PBS'yi dikkatlice ekleyin, hücreler bu adımda çok kırılgandır.
7. Hücre fiksasyonu için her oyuğa 200 μL% 4 (h / h) PFA ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin. PFA'yı tamamen çıkarın.
8. 1 mL PBS.
   ekleyin not: Hücreler PBS'de 4 °C'de saklanabilir.

2. İmmünofloresan boyama

1. Engelleme çözeltisi hazırlayın:% 5 BSA'yı (a / h) PBS'de çözün ve% 0.3 (h / h) Triton X-100 ekleyin. Tamamen eriyene kadar karıştırın.
2. Seyreltme tamponu hazırlayın:% 1 BSA'yı (a / h) PBS'de çözün ve% 0.3 (h / h) Triton X-100 ekleyin. Tamamen eriyene kadar karıştırın.
3. Blokaj için, her kuyucuğa 200 μL bloke edici çözelti ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat veya 4 °C.
   'de 16-18 saat inkübe edin not: Keçi antikoru kullanılacaksa, bloke edici çözeltiye% 5 keçi serumu ekleyin.
4. Seyreltme tamponunda birincil antikoru seyreltin (1:500; antikor listesi için Tablo 1'e bakınız) ve iyice karışana kadar girdap.
   not: Keçi antikoru kullanılıyorsa, seyreltme tamponuna% 1 keçi serumu ekleyin.
5. Bir nem/inkübasyon kutusuna bir parça parafilm yapıştırın. 10 μL primer antikor ekleyin (tek bir damlada). Lamelin bir kenarını damla ile hizalayın ve sıvının yayılması için yavaşça parafilmin üzerine indirin (mümkünse kabarcıklardan kaçının). Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
6. Lamelleri PBS'de 1 dakika boyunca üç kez yıkayın.
7. İkincil antikoru seyreltme tamponunda seyreltin (son konsantrasyon: 2 μg/mL) ve iyice karışana kadar girdaplayın.
8. Primer antikorlar için tarif edildiği gibi 10 μL sekonder antikor uygulayın. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
   not: Işıktan koruyun.

Tablo 1: Kullanılan antikorlar. Bu çalışmada kullanılan antikorların listesi.

(İngilizce)

antikor	şirket	referans	kaynak
53BP1	Hücre Sinyalizasyonu	4937	tavşan
Anti-Fare IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam Belediyesi	ab150103	eşek
Anti-fosfo-histon H2A. X (Ser139), klon JBW301	Kırlangıç	05-636	fare
Anti-Tavşan IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam Belediyesi	ab150081	keçi

1. Lamelleri PBS'de 1 dakika boyunca üç kez yıkayın.
2. Lamelleri H₂O ile 1 dakika yıkayın.
3. DNA'yı DAPI ile Karşı Lekeleyin: 10 μL 300 nM DAPI (antikorlar için tarif edildiği gibi) uygulayın, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve ardından gliserol bazlı bir montaj ortamı ile cam slayt üzerine monte edin. Alternatif olarak, bir slayt üzerine DAPI içeren bir damla (10 μL) ticari antifade montaj ortamı ekleyin ve bir lamel uygulayın. Lameli hafifçe bastırın ve etrafındaki fazla sıvıyı bir kağıt havluyla alın.
4. Lamelleri şeffaf oje ile kapatın ve 20 dakika kurumaya bırakın.
5. Slaytları 4 °C'de saklayın.

3. Görüntü elde etme

1. 60x objektif merceğine bir damla daldırma yağı koyun. Çekirdeği göz merceğinden bulmak için DAPI'yi kullanın.
   1. XYZ görüntü alımı için, toplama yazılımını açın ve parametreleri seçin: Tarayıcı tipi: Galvano; Tarayıcı modu: Gidiş-dönüş; Görüntü boyutu: 512×512; PMT modu: VBF; PMT ortalaması: çerçeve (4 kez); PMT sıralı tarama: satır.
   2. Boyayı ve dedektörleri seçin:
      Kanal (CH1), Boya (DAPI), Dedektör (SD1)
      Kanal (CH2), Boya (Alexa Fluor 488), Dedektör (HSD3)
      Kanal (CH3), Boya (Alexa Fluor 647), Dedektör (HSD4)
   3. "Z" içinde AÇIK'ı seçin.
2. Canlı görüntüyü ayarlayın. Canlı penceresindeki Canlı düğmesine basın.
   1. Odağı ayarlayın ve "PMT" araç penceresinde lazer yoğunluğunu (%), hassasiyeti (HV), kazancı ve ofseti ayarlayın.
      1. Parlaklık ve ağartma için lazer yoğunluğunu (%): ayarlayın. Lazer yoğunluğu ne kadar yüksek olursa, sinyal o kadar güçlü olur, ancak numune foto ağartıcı olacaktır.
      2. Hassasiyeti (HV) ayarlayın: gürültü seviyesi. HV ne kadar yüksek olursa, sinyal o kadar güçlü olur, ancak çok yüksekse görüntü gürültülü olur.
         NOT: Voltajı her zaman sabit tutun.
      3. Ofseti ayarlayın: arka plan seviyesi.
   2. Z yığınları için Başlangıç/Bitiş (15 dilim) öğesini seçin.
3. Satın alma işlemini başlatın.
   1. Görüntülerin kaydedileceği klasörü seçin. Görüntüyü almaya başlamak için LSM Başlat düğmesine basın. Görüntü alımını tamamlamak için Series Done düğmesine basın.

Sonuçlar

Şekil 1. Nükleer çıkarma.

Nükleer ekstraksiyondan önceki (solda) ve sonra (sağda) hücrelerin temsili görüntüleri. Sitoplazma sindirilmelidir, ancak nükleer yapı ekstraksiyon sonrası bozulmadan kalmalıdır (sağda). (A) 20x büyütme; ölçek çubuğu = 20 μm ve (B) 40x büyütme; ölçek çubuğu = 10 μm.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Kapak camı #1, 18 mm yuvarlak (lameller)	Neuvitro (Nötritro	NC0308920	Lamellerin kullanılmadan önce HCl veya etanol ile temizlenmesi ve sterilize edilmesi gerekir.
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok	Gibco (Gibco)	14190144	Doku kültürü için PBS
DAPI ile SlowFade Elmas Antifade Mountant	Canlandırıcı	S36973 Serisi	Bunun yerine VECTASHIELD Antifade Montaj Ortamlı 300 nM DAPI kullanılabilir.
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Yağışı/arka planı önlemek için ısı şoku fraksiyonu önerilir.
Triton X-100	Amerikan Biyografisi	AB02025	Nükleer ekstraksiyon tamponu.
Superfrost Plus Mikroskop Slaytları	Balıkçı markası	1255015	Bunun yerine Polisinüs Slaytları kullanılabilir.