Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

Özet

Kaynak: Kresoja-Rakic, J., et al. Desthiobiotin-Streptavidin-Afinitesi Mezotelyoma Hücrelerinde RNA Etkileşimli Proteinlerin Saflaştırılmasına Aracılık Etti. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, mRNA'daki adenilat-üridilat açısından zengin element (ARE) dizileri ile etkileşime giren RNA bağlayıcı proteinleri (RBP'ler) tanımlamak için bir in vitro RNA aşağı çekme testini göstermektedir. Bir hücre lizatından gelen hedef RBP'ler, RNA-protein kompleksleri oluşturmak için bir RNA probu ile karıştırılır. Kompleksler, RNA probunun destiyobiyotin etiketinin streptavidin etiketli bir manyetik boncuğa afinitesi kullanılarak afinite saflaştırması yoluyla izole edilir.

Protokol

1. Sitozolik ve Nükleer Protein Fraksiyonunun Hazırlanması

1. Plaka 4 x 10⁶ ACC-MESO-4 hücresi, %10 FBS, 1x penisilin / streptomisin (100x) ve 2 mM L-Glutamin (200 mM) ile desteklenmiş RPMI - 1640 ortamında büyütülmüş bir T150 hücre kültürü şişesinde. Hücreler% 80-90'lık bir birleşime ulaştığında (~ 5-5.5 x 10⁶ hücre), nükleer ve sitozolik fraksiyonların protein ekstraksiyonu ile devam edin.
   not: ACC-MESO-4 hücre hattı, RIKEN Biyokaynak Merkezi'nden elde edildi.
2. Ortamı aspire edin, 15 mL 1x PBS ekleyerek hücreleri yıkayın, plakayı birkaç kez hafifçe eğin ve 1x PBS'yi aspire edin. 3 mL% 0.25 Tripsin-EDTA ekleyin ve kültür şişesini 37 ° C'de 3 dakika < br / > inkübe edin not: Ayrılma için mikroskop altındaki hücrelere bakın; Hala takılıysa, şişeyi bir elinizin avucuna 3 kez vurun.
3. % 10 FBS, 1x penisilin / streptomisin (100x) ve 2 mM L-Glutamin (200 mM) ile takviye edilmiş 7 mL RPMI-1640 ortamı ekleyin, hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün.
4. Ortamı aspire edin ve hücre peletini 1.5 mL 1x PBS ile yeniden süspanse edin, ardından hücreleri 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 500 x g ve 4 °C'de 5 dakika döndürün. Süpernatantı atın.
   not: Bu adımdan itibaren tüm santrifüj adımlarını 4 °C'de gerçekleştirin ve tüm reaktifleri buz üzerinde tutun.
5. Hücre peletini buz gibi soğuk 1.5 mL 1x PBS ile yeniden süspanse edin ve hücreleri 500 x g ve 4 ° C'de 3 dakika döndürün. Süpernatantı atın.
   not: Gerekli miktarlarda CER I, CER II, ve NER reaktifleri sırasıyla 10, 0.55 ve 5 hacim tahmini hücre peleti paketlenmiş hacmidir; Aşağıdaki protokol 20 μL'lik bir hacim varsayar. Sadece gerekli miktarda CER I reaktifi hazırlamanızı öneririz.
6. 2 μL 1x proteinaz inhibitörü ile takviye edilmiş 200 μL buz gibi sitoplazmik ekstraksiyon reaktifi (CER I) ekleyin, ör., 100x stok elde etmek için 1 tablet Proteaz İnhibitörü (EDTA içermeyen) 500 μL su ile seyreltin. Bu reaktif miktarı CER I, 20 μL'lik bir hücre peleti ile paketlenmiş hacmi parçalamak için yeterlidir.
   1. Hücre peletiyle paketlenmiş hacmi tahmin etmek için, hücre peletini içeren tüpü 10, 20, 50 veya 100 μL 1x PBS ile doldurulmuş 1,5 mL'lik bir tüple karşılaştırın.
7. Tüpü 15 saniye boyunca kuvvetlice girdaplayarak hücre peletini yeniden süspanse edin ve tüpü 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Tüpe 11 μL buz gibi soğuk sitoplazmik ekstraksiyon reaktifi II (CER II) ekleyin, 5 saniye kuvvetlice girdap yapın ve buz üzerinde 1 dakika inkübe edin.
8. 5 saniye boyunca kuvvetlice vorteksleyin ve tüpü 16.000 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı buz üzerinde önceden soğutulmuş temiz tüpe aktarın. Süpernatant, RNA-pulldown deneyinde daha fazla kullanılan sitoplazmik fraksiyondur.
9. Kalan peleti 1 μL proteinaz inhibitörü (100x) ile takviye edilmiş 100 μL buz gibi soğuk nükleer ekstraksiyon reaktifi (NER) içinde yeniden süspanse edin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın. Yalnızca proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş gerekli miktarda NER reaktifinin hazırlanmasını öneririz.
10. Numuneyi 40 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve ara sıra 15 saniye boyunca girdap yapın (her 10 dakikada bir).
11. Tüpü 10 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı (bu nükleer protein fraksiyonudur) temiz, önceden soğutulmuş bir tüpe aktarın.
12. Hemen biskinkoninik (BCA) yöntemini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçerek devam edin (bkz. Malzeme Tablosu). Her fraksiyonun protein saflığını kontrol etmek için, α-tubuline (sadece sitozolik fraksiyonda pozitif tespit) ve Poli ADP-riboz polimeraz - PARP'a (sadece nükleer fraksiyonda pozitif tespit) karşı immünoblotlama (Şekil 1) gerçekleştirin.
13. Protein aktivitesini ve doğal hallerini korumak için, 25 μL sitozolik ve nükleer ekstraktlar hazırlayın. Bu alikotları 5 saniye boyunca sıvı nitrojen içine koyarak dondurun ve doğrudan -80 °C'de saklayın.

2. RNA'nın Desthiobiotin ile etiketlenmesi

1. RNA problarının ticari olarak sentezlenmesini ve HPLC'nin saflaştırılmasını sağlayın. 10 μM.
   'de nükleaz içermeyen su ile tekrar süspansiyon not: Prob dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.
2. RNA çekme reaksiyonu başına 50 pmol RNA kullanın. RNA oligo'nun 30' terminalini etiketlemek için kullanılan PEG %3 dışındaki tüm reaktifleri çözün ve buz üzerinde tutun.
3. CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) ve İlişkisiz-RNA (IRE) olarak etiketlenmiş 5 μL'lik 10 μM RNA probunu 0.5 mL ince duvarlı mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 85 ° C'de 5 dakika boyunca bir PCR makinesinde inkübe edin. Tüpleri hemen buzun üzerine yerleştirin.
   not: Bu adım, etiketleme için RNA probunun gevşemesini ve erişilebilirliğini teşvik ettiği için önemlidir.
4. Tek bir 30 μL reaksiyon için, RNA içeren tüpe aşağıdaki 10 μL karışımı ekleyin: 3 μL nükleaz içermeyen su, 3 μL 10x RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu, 1 μL RNaz İnhibitörü (40 U/μL), 1 μL Destiyobiyotinillenmiş Sitidin Bifosfat (1 mM) ve 2 μL T4 RNA ligaz (20 U/μL).
   not: Fazla 3 numune (3.2) için bir ana karışım A hazırlamak için, 9.6 μL nükleaz içermeyen su, 9.6 μL 10x RNA Ligaz Reaksiyon Tamponu, 3.2 μL RNaz İnhibitörü (40 U/μL), 3.2 μL Desthiobiotinile Sitidin Bisifosfat (1 mM) ve 6.4 μL T4 RNA ligaz (20 U/μL).
5. Reaksiyona dikkatlice 15 μL PEG% 30 ekleyin. Reaksiyonu karıştırmak için başka bir ipucu kullanın. Reaksiyonu gece boyunca 16 °C'de inkübe edin.
6. Ertesi gün aşağıdakileri hazırlayın: 5 M NaCl (taze/nükleaz içermez), kloroform: 24:1 oranında izoamil alkol (örneğin, reaksiyon başına - 96 μL kloroform ve 4 μL izoamil alkol), buz gibi %100 etanol ve buz gibi %70 etanol.
7. RNA etiketleme reaksiyon tüplerine 70 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. 100 μL kloroform ekleyin: izoamil alkol ve kısaca girdap. 3 dakika boyunca 13.000 x g'da döndürün. YALNIZCA üst fazı dikkatlice çıkarın ve nükleaz içermeyen 1,5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın; Alt faza dokunmaktan kaçının.
8. 10 μL 5 M NaCl, 1 μL glikojen ve 300 μL buz gibi %100 etanol ekleyin. Tüpü 2 h.
   için -20 °C'ye yerleştirin not: Bu adımda, deneye ertesi gün devam edilebilir.
9. 13.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. 300 μL buz gibi %70 etanol ekleyin ve 13.000 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
10. Süpernatanı tamamen atın ve peleti havayla kurutun (15 dakika). Peletleri 20 μL nükleaz içermeyen suda tekrar süspanse edin.
    not: Aynı gün RNA pulldown ile devam edin.
11. RNA'yı 90 °C'de 2 dakika inkübe edin ve buzun üzerine yerleştirin. Streptavidin manyetik boncuklarının bir sonraki ön yıkama adımı sırasında etiketli RNA'yı buzun üzerine yerleştirin.
    not: Daha uzun bir inkübasyon süresi RNA probuna zarar verebilir.

3. RNA-Protein Pulldown

1. Streptavidin manyetik boncukların ön yıkanması ve desthiobiotin-RNA ile inkübasyon
   1. 50 pmol RNA başına 50 μL streptavidin manyetik boncuk kullanın. Ancak, deneye bağlı olarak bu optimize edilmelidir.
   2. Tüpü streptavidin-manyetik boncuklarla 15 saniye boyunca vorteksleyin ve kesilmiş pipet uçlarını kullanarak 200 μL'yi (ana karışım; 3 + 1 reaksiyon için yeterli) temiz bir 1,5 mL güvenli kilitli tüpe hızla çıkarın. Tüpü, boncukların tüpün yanında toplanması için manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve 1 dakika bekleyin. Yeniden süspansiyon sıvısını çıkarın.
   3. Boncukları yıkamak için tüpü manyetik standdan çıkarın, 400 μL 0.1 M NaOH ve 0.05 M NaCl çözeltisi ekleyin ve birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Tüpü manyetik standa geri yerleştirin. 1 dakika bekleyin ve süpernatanı toplayın. Bu adımı tekrarlayın.
   4. Boncukları 200 μL 100 mM NaCl ile yıkayın. Süpernatanı çıkarın.
   5. 200 μL 20 mM Tris (pH 7.5) ekleyin, boncukları pipetleyerek yeniden süspanse edin, tüpü manyetik standa yerleştirin, 1 dakika bekleyin ve süpernatanı çıkarın. Adımı tekrarlayın.
   6. Tüpü manyetik standdan çıkarın, 200 μL 1x RNA Yakalama tamponu ekleyin ve streptavidin manyetik boncuklarını kısaca girdaplayarak yeniden askıya alın. 50 μL streptavidin manyetik boncuklarını çıkarın ve kesilmiş bir pipet ucu kullanarak etiketli her RNA tüpüne ekleyin. Tüpleri bir rulo üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
2. Proteinin RNA'ya bağlanması
   1. Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin, 1 dakika bekleyin ve süpernatanı çıkarın.
   2. Boncuklara 50 μL 20 mM Tris (pH 7.5) ekleyin ve pipetleme ile yeniden süspanse edin. Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin, 1 dakika bekleyin ve süpernatanı çıkarın. Bu adımı tekrarlayın.
   3. Boncuklara 100 μL 1x Protein-RNA bağlayıcı tampon ekleyin ve pipetleme ile yeniden süspanse edin.
   4. Bu arada, aşağıdaki karışımı hazırlayın: 10 μL 10x Protein-RNA bağlayıcı tampon, 30 μL %50 gliserol, 50 μg sitoplazmik protein ve 100 μL.
      'ye kadar nükleaz içermeyen su not: Fazla 3 numune (3.3) için aşağıdaki gibi bir ana karışım B hazırlayın: 33 μL 10x Protein-RNA bağlayıcı tampon, 99 μL %50 gliserol, 165 μg sitoplazmik protein ve 330 μL'ye kadar nükleaz içermeyen su. Ana karışım B tüpünü buz üzerinde tutun.
   5. Tüpleri manyetik standa yerleştirin, 1 dakika bekleyin ve süpernatanı toplayın. 100 μL ana karışım B ekleyin, yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek yeniden süspanse edin ve kabarcık oluşturmaktan kaçının. Reaksiyon tüplerini bir silindir üzerinde 4 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
3. Yıkama ve elüsyon
   1. Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin, süpernatanı toplayın (içinden geçen - FT) ve yeni bir tüpe aktarın.
      not: Daha sonra analiz etmek için bu FT'yi buz üzerinde tutun.
   2. Boncukların üzerine 100 μL 1x Yıkama tamponu pipetleyin, yavaşça yeniden süspanse edin, manyetik standa geri koyun, 1 dakika bekleyin ve süpernatanı atın. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
   3. Manyetik boncuklara 40 μL Elüsyon Tamponu ekleyin, yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve 37 °C'de bir tüp çalkalayıcı (950 rpm) üzerinde 30 dakika inkübe edin.
   4. Tüpleri manyetik bir standa yerleştirin, 1 dakika bekleyin ve ayrıştırılmış numuneyi (elüat - E) toplayın. Buzun üzerine yerleştirin ve aşağı akış analizi için kullanın.
      not: Bu adımda, test edilen her RNA probu, bir akış (FT) ve elüat (E) örneğinden oluşur.

Sonuçlar

Şekil 1: 5 μg sitozolik ve nükleer protein fraksiyonunun Western blot analizi. PARP proteini nükleer fraksiyonda (N) bulunur, ancak sitozolik (C) fraksiyonda yoktur. α-tubulin, sitozolik fraksiyonda (C) bulunur, ancak nükleer fraksiyonda (N) yoktur.

Tablo 1: RNA problarının dizileri

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NE-PER Nükleer ve sitoplazmik ekstraksiyon kiti	Thermo Fisher Bilimsel	78833
Pierce Proteaz İnhibitör Tabletleri, EDTA içermez	Thermo Fisher Bilimsel	A32965
Pierce BCA Protein Test Kiti	Thermo Fisher Bilimsel	23225
Pierce Manyetik RNA-protein Aşağı Çekme Kiti	Thermo Fisher Bilimsel	20164	Manyetik boncuklar içerir ve bu nedenle kitin 4 °C'de saklanması gerekir
Pierce RNA 3' Uçlu Desthiobiotinilasyon Kiti	Thermo Fisher Bilimsel	20163	Kit, "Pierce Manyetik RNA-protein Pull-Down Kit"in bir parçasıdır ve aşağı çekme kitinden (4 °C) farklı olarak -20 °C'de saklanması gerekir.
DynaMag-2, manyetik stand	Thermo Fisher Bilimsel	12321D
RPMI - 1640 orta	Sigma-Aldrich	R8758 Serisi
FBS - Filtrelenmiş Sığır Serumu	Pan Biyoteknoloji	P40-37500 Serisi
Penisilin - streptomisin (100x)	Sigma-Aldrich	P4333 Serisi
L-Glutamin çözeltisi (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
% 0.25 Tripsin-EDTA (1x)	Gibco by Life teknolojileri	25200-056
RNaseZap RNase Dekontaminasyon Solüsyonu	Thermo Fisher Bilimsel	AM9780
RNA oligo sentezi	Mycrosynth AG, İsviçre	-	Sentez ölçeği - 0.04 μmol - HPLC ile saflaştırılmış
Sığır serum albümini	Sigma-Aldrich	A7030
Hidroklorik Asit (HCl) 6 m	PanReac Uygulaması	182883.1211
Ultra Saf 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Bilimsel	15567027
Gliserol	Thermo Fisher Bilimsel	17904	-20 ° C'de saklanacak% 50 steril alikotlar
Pierce Streptavidin manyetik boncuklar	Thermo Fisher Bilimsel	88817	Lütfen bu manyetik boncukların ortalama 1 μm çapa sahip olduğunu unutmayın (0,5 - 1,5 μm aralığında). Ayrıca, homojen boyutu 2,8 μm olan Dynabeads-M280 Streptavidin de RNA pulldown'da kullanılır, ancak bunun saflaştırma işlemini etkileyebileceğini unutmayın.
Alüminyumsülfat-(14-18)-hidrat	Sigma-Aldrich	368458
Orto-fosforik asit	Uygulama	A0637