$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Protein bağlanma reaksiyonu ve bağlı RNA'nın ayrılması
- Bu nihai konsantrasyonlara aşağıdaki bileşenleri ekleyerek 100 μL'lik bir hacimde 10 mM Tris-HCl, pH 7.5'te protein ve RNA'nın bağlanmasını gerçekleştirin: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.09 μg/μL sığır serum albümini, 0.5 ünite/μL RNasin, 0.15 μg/μL tRNA, 1 mM EDTA, ve 30 μL uygun rekombinant protein (PTB) konsantrasyonu. Uygun havuzdan RNA ekleyin.
not: Ekleme faktörü U2AF65 tipik olarak, yaklaşık 1-10 nM'lik bir bağlanma afinitesi (denge ayrışma sabiti veya Kd) ile model intronların polipirimidin yolu/3' ekleme bölgelerine bağlanır. Bu nedenle, ilk iki bağlanma turu, U2AF65 için KD'nin 10 kat üzerinde protein konsantrasyonu kullandı; SXL ve PTB proteinleri için, bu aralıktaki başlangıç konsantrasyonu sadece en iyi tahminimizdi. Bu, istenen RNA türlerinin bağlanabilmesini sağladı, ancak daha düşük afinite dizileri de potansiyel olarak bağlıydı. 3. ve 4. turlarda (transkripsiyon, bağlanma ve amplifikasyon), protein konsantrasyonu üç kat azaltıldı. Bu, düşük afiniteli RNA türlerini başarılı bir şekilde ortadan kaldırmak için yapıldı.
- Bağlanma reaksiyonlarını içeren tüpleri 25 ° C'de yaklaşık 30 dakika boyunca bir sıcaklık bloğuna (veya buzun) yerleştirin.
- Aşağıdaki adımları kullanarak seçim-amplifikasyonun ilk 4 turu için bağlı RNA'yı bağlanmamış RNA'dan parçalara ayırın.
- Numuneyi (100 μL) oda sıcaklığında bir vakum manifolduna bağlı bir nitroselüloz filtreden süzün.
not: RNA-protein kompleksi, ancak bağlanmamış RNA değil, filtrede kalır.
- Tutulan RNA'ya sahip filtreyi steril bir tıraş bıçağıyla parçalara ayırın; bunları bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Filtre parçaları proteinaz K (PK) tamponuna daldırılmış halde tüpü en az 3 saat (veya gece boyunca) hafifçe döndürerek RNA'yı geri kazanın.
- RNA örneğini, eşit hacimde fenol-kloroform (1:1) ve ardından kloroform varlığında girdaplayarak deproteinize edin. Numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yüksek hızda santrifüjleyerek her seferinde sulu fazı geri kazanın.
- Sodyum asetat (0.1 hacim 3.0 M, pH 5.2) ve etanol (2-3 hacim mutlak etanol, 200 geçirmez) ile karıştırın. Tüpü -80 °C'lik bir dondurucuda 30 dakika bekletin, 10 dakika boyunca yüksek hızda santrifüjleyin ve yıkama ve kurutma adımlarını takip ederek RNA'yı DEPC ile muamele edilmiş suda çözündürün.
- Proteine bağlı RNA fraksiyonlarını, son 2 tur (5. ve 6. turlar; transkripsiyon, bağlanma ve amplifikasyon) için bağlanmamış fraksiyonlardan aşağıdaki gibi ayırın. Yüksek afiniteli bağlanma dizilerini zenginleştirmek ve tercihen düşük afiniteli dizileri çıkarmak için ek seçim baskısı için bağlanma reaksiyonundaki protein konsantrasyonunu (adım 1.1) üç kat daha azaltın.
- Yukarıdaki RNA: protein bağlama (aşama 1.1) reaksiyonunu ayarlamadan önce 0.5x TBE tamponunda (Tris-Borat-EDTA) doğal bir poliakrilamid jeli (60:1 akrilamid: bis-akrilamid oranı ile %5) önceden döküm. Bu jeli soğuk bir odada (4 °C) 15 dakika boyunca 250 V uygulayarak elektroforez.
- Yukarıdaki RNA'yı pipetleyin: protein bağlanma reaksiyonları (adım 1.1) bu jelin farklı kuyucuklarına
not: Protein -80 ° C'de saklanır ve kullanımdan önce 20 mM 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES), pH 8.0,% 20 gliserol, 0.2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA),% 0.05 NP-40 ve 1 mM ditiotreitol (DTT). 0,5-1,0 mM proteaz inhibitörü fenilmetan sülfonil florür (PMSF) ilavesi isteğe bağlıdır. Bağlanma reaksiyonunda, bu tampon yaklaşık% 6 gliserole katkıda bulunur, bu da numunelerin ayrı bir jel yükleme tamponu ile karıştırılmasına gerek kalmadan kuyucuklara doğrudan yüklenmesine izin verir.
- Bağlı RNA'yı, 1 ila 2 saat boyunca 250 V'ta soğuk bir odada (4 ° C) jel elektroforezi kullanarak bağlanmamış RNA'dan ayırın. Bu işlem aynı zamanda jel hareketlilik kayma testi olarak da bilinir.
NOT: Elektroforez süresi, RNA'nın özelliklerine ve bağlanma için kullanılan proteine bağlı olarak değişir.
- Jeli bir X-ışını filmine maruz bırakın ve otoradyografi kullanarak bağlı RNA'nın yerini belirleyin. Bağlı RNA ile jel dilimini kesin ve bir tüpe yerleştirin.
- Ezilmiş jel dilimini 3 saat veya gece boyunca elüsyon için kullanılan PK tamponunda inkübe edin.
- Ayrıştırılmış RNA örneğini önce fenol-kloroform ve ardından kloroform ile kuvvetlice vorteksleyin.
- Kloroform ekstraksiyonundan sonra sodyum asetat ve etanolü sulu faz ile karıştırın. -80 °C'lik bir dondurucuda inkübasyonun ardından, RNA peletini toplamak için 4 °C'de 5-10 dakika döndürün. RNA peletini etanol ile yıkayın ve tüpün kapağını açık bırakarak havayla kurutun. RNA'yı DEPC.
ile muamele edilmiş suda çözün
not: Fraksiyonlama için jel hareketlilik kaydırma testine geçmek, örneğin fraksiyonlama için ilk turlarda kullanılan nitroselüloz filtreye (veya herhangi bir matrise) bağlanmak için zenginleştirilmiş olabilecek istenmeyen RNA türlerinin ortadan kaldırılmasına izin verir.
2. Ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu
- 20 μL reaksiyonu (2 μL 10x RT Tamponu, 2 μL AMV ters transkriptaz, 1 μM ters primer, 10 μL RNA, isteğe bağlı RNaz inhibitörü) 42 ° C'de 60 dakika inkübe ederek ters transkriptaz ve ters primer kullanarak çözünmüş RNA'dan cDNA'yı sentezleyin.
- 20-25 PCR döngüsü kullanarak cDNA'yı amplifiye edin. T7 RNA polimeraz promotörünü, 1 μM DNA rastgele kütüphane şablonu, her primerden 1 μM, 20 mM Tris (pH 8.0), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1 μg/μL asetillenmiş sığır serum albümini, 2 birim Taq polimeraz ve 200 μM dNTP (deoksiguanozin, deoksiadenozin, deoksisitidin ve deoksitimidin trifosfat).
3. Transkripsiyon ve protein bağlanması
- RNA sentezi, protein bağlanması ve proteine bağlı ve bağlanmamış fraksiyonların ayrılması işlemini tekrarlayın.