Çözeltideki protein-lipid etkileşimlerini incelemek için mikro ölçekli termoforez

Özet

Kaynak: Sparks, R. P. ve diğerleri, Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı.J. Vis. Uzm.(2022)

Bu video, protein-lipid etkileşimini incelemek için mikro ölçekli termoforezi göstermektedir. Tahlil, bir sıcaklık gradyanına yanıt olarak floresan etiketli proteinlerin termoforetik hareketini ölçerek moleküller arasındaki etkileşimi tespit eder. Floresan molekülü, floresan olmayan lipid moleküllerinin farklı konsantrasyonları ile karıştırılır ve çözeltideki moleküllerin karışımı kılcal damarlara yüklenir. Kılcal damarlardaki numunelere bir sıcaklık gradyanı uygulanır ve floresan molekülünün sıcaklık gradyanındaki hareketi tespit edilir ve kaydedilir.

Protokol

1. Malzemelerin hazırlanması

1. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) hazırlayın: 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM NaH₂PO₄ ve 2 mM KH₂PO_4, pH 7.4.
2. NTA-Atto 647 N boyasını hazırlayın. Stok NTA-Atto 647 N boyasını% 100 DMSO çözeltisinden 100 nM'ye seyreltin.
3. Vam7-His8 - E. coli'de bir füzyon proteini olarak proteini eksprese edin ve Ni-NTA ve boyut dışlama kromatografisi kullanarak saflaştırın.
4. Analiti PBS tamponunda titre edin. Analit farklı bir tampondaysa, etiketli MST, analit tamponunun içeriği etiketli protein ile etkileşime girmedikçe, DMSO gibi moleküllerden gelen küçük tampon farklılıklarına özellikle duyarlı değildir.

2. MST cihazının hazırlanması

1. Cihazın arkasındaki güç anahtarını açın.
2. Kontrol yazılımını açın ve cihaza bağlı bilgisayarda dizüstü bilgisayarın açık ve bağlı durumda olduğundan emin olun.
3. Bu deney için floresan ve MST ayarlarını girin. MST'yi Önce 3 sn'ye, MST'yi 30 sn'ye ve Floresan geri kazanımını (Fluo.) ayarlayın.1 s sonra. İlk floresanı ölçmeden önce ve uzun süreler gerektirmez; MST, ısı indüksiyonundan sonra dengeye ulaşılması için gerçek süredir.
4. Kılcal Damarlar Tablosu: Her kılcal boru için hedefin adını (ligand), ligandın adını (analit), hedefin konsantrasyonunu ve en yüksek titrasyon konsantrasyonunu girin ve otomatik doldurma titrasyon oranını kullanın. Örneğin, Vam50-His7'in hedef konsantrasyonu için 8 nM, hedef ad için Vam7-His8, ligand adı için (1,2-dioktanoil fosfatidik asit) Di-C8 PA ve ligandın en yüksek konsantrasyonu 1:1 seçerek ve otomatik doldurma yuvaları 2-16'ya sürükleyin.
5. Hedef proteinin sinyaline dayalı olarak uygun LED'i (%20 LED (önceden ayarlanmış)) seçmek için bir Kapak Taraması yapın ve etiketli MST için 200 ila 2000 floresan birimi arasında ayarlayın. Kapak Taramaları, tek tip yuvarlak çan şeklinde tepeler göstermelidir.
6. En sağlam bağlama uyumunu test etmek için bir dizi MST gücü seçin ve her biri için değerler girin ve test edilen etkileşim için en iyi çalışma koşullarını belirlemek üzere farklı değerleri tarayarak Kapak Taraması + Ölçümü Başlat'a basın.
7. Analiz yazılımını ve Tjump ile termoforez için ön ayarı kullanarak MST gücünü en uygun şekilde belirleyin. En düşük ve en yüksek konsantrasyon arasındaki floresan ayrımına göre, en iyi uyan MST gücüyle karşılaştırıldığında, uyumları analiz edin ve çoğaltma denemeleri için MST gücünü seçin.
8. Analiz yazılımına giderek ve analizi uzman moduna geçirerek birinci ve ikinci çalışma arasında foto ağartma olup olmadığını belirleyin. Ardından, analiz için termoforez yerine floresan seçin. Uzman modunu seçin ve ardından foto ağartmayı seçin.

>3. Etiketli MST için numunelerin hazırlanması

1. Vam7-His8 çözeltisini Tween olmadan PBS'de 200 nM'lik bir konsantrasyona getirin.
2. NTA-Atto 647 boyasını Tween olmadan PBS'de 100 nM'ye getirin.
3. Vam7-His8 ve NTA-Atto 647 boyasını 1:1 hacimsel oranda karıştırın ve 30 dakika boyunca ışıktan kapalı oda sıcaklığında bekletin. Bölüm 2.5'teki gibi uygun hedef protein konsantrasyonunu belirleyin (videoda gösterildiği gibi Ni-NTA boyasının KD kullanımına ilişkin Ek'e bakınız).
4. NTA-Atto 647 N boya ve protein karışımını karanlık bir odada yaklaşık 8.161 x g'da bir masa üstü santrifüj kullanarak 10 dakika
santrifüjleyin.
5. Proteinin denatüre olmasını önlemek için karışımı deneyden sonra 4 °C'de veya deney sırasında buz üzerinde saklayın ve gerekirse birkaç saat içinde yeniden kullanın.
6. Titrasyon için gereken konsantrasyon aralığını belirlemek için NT konsantrasyon bulucuyu kullanın.
7. Di-C8 PA'yı suda uygun maksimum konsantrasyona getirin.
8. Önceki adıma göre 16 konsantrasyon için PBS tamponunda 1:1 seri seyreltme kullanarak analiti titre edin. SPR'den farklı olarak, termoforez tampon farklılıklarına karşı o kadar hassas değildir.

4. Örneklerin MST'si

1. Cihazı ve bağlı dizüstü bilgisayarı açın.
2. Makinenin önündeki yukarı oka basın ve kılcal rafı dışarı kaydırın.
3. Kılcal damarları 1 konumunda en yüksek konsantrasyona sahip rafa yükleyin.
4. Kontrol yazılımında, NTA-Atto 647 N'ye karşılık gelen Kırmızı Kanalı seçin.
5. Kılcal Damarlar Tablosuna her bir kılcal damar için konsantrasyon, konum ve isim bilgilerini girin.
6. %20 LED'de (önceden ayarlanmış) Kapak Taramayı Başlat'a basarak bir kılcal tarama yapın ve LED yoğunluk ayarlarını veya ligand konsantrasyonunu (etiketli protein) kullanarak 200 ila 2000 floresan birimi arasında buna göre ayarlayın.
7. Bir MST güç aralığı seçin.
8. Kapak Taraması + MST Ölçümünü Başlatın.
9. Analiz yazılımını kullanarak analiz edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cy5 Maleimid Mono-Reaktif Boya	GE Sağlık	PA23031	Protein etiketleme için
GraphPad Prizma	GraphPad yazılımı
Monolith NT.115 Kılcal Damarlar (1000 adet)	Nano temper	MO-K022	MST için kılcal damarlar
Monolit NT.115 makinesi	Nano temper		Üniversite ekipmanları
NTA-ATTO 647 N	Sigma	2175	Etiketleri için etiket
Fosfatidilinositol 3-fosfat diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Bağlanma deneyleri için lipit

Serisi Serisi