Çözeltideki protein-lipid etkileşimlerini incelemek için mikro ölçekli termoforez

Özet

Kaynak: Sparks, R. P. ve diğerleri, Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı.J. Vis. Uzm.(2022)

Bu video, protein-lipid etkileşimini incelemek için mikro ölçekli termoforezi göstermektedir. Tahlil, bir sıcaklık gradyanına yanıt olarak floresan etiketli proteinlerin termoforetik hareketini ölçerek moleküller arasındaki etkileşimi tespit eder. Floresan molekülü, floresan olmayan lipid moleküllerinin farklı konsantrasyonları ile karıştırılır ve çözeltideki moleküllerin karışımı kılcal damarlara yüklenir. Kılcal damarlardaki numunelere bir sıcaklık gradyanı uygulanır ve floresan molekülünün sıcaklık gradyanındaki hareketi tespit edilir ve kaydedilir.

Protokol

1. Malzemelerin hazırlanması

1. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) hazırlayın: 137 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM NaH₂PO₄ ve 2 mM KH₂PO_4, pH 7.4.
2. NTA-Atto 647 N boyasını hazırlayın. Stok NTA-Atto 647 N boyasını% 100 DMSO çözeltisinden 100 nM'ye seyreltin.
3. Vam7-His8 - E. coli'de bir füzyon proteini olarak proteini eksprese edin ve Ni-NTA ve boyut dışlama kromatografisi kullanarak saflaştırın.
4. Analiti PBS tamponunda titre edin. Analit farklı bir tampondaysa, etiketli MST, analit tamponunun içeriği etiketli protein ile etkileşime girmedikçe, DMSO gibi moleküllerden gelen ....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Cy5 Maleimid Mono-Reaktif Boya	GE Sağlık	PA23031	Protein etiketleme için
GraphPad Prizma	GraphPad yazılımı
Monolith NT.115 Kılcal Damarlar (1000 adet)	Nano temper	MO-K022	MST için kılcal damarlar
Monolit NT.115 makinesi	Nano temper		Üniversite ekipmanları
NTA-ATTO 647 N	Sigma	2175	Etiketleri için etiket
Fosfatidilinositol 3-fosfat diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Bağlanma deneyleri için lipit

Serisi Serisi