Etiketli Protein-Fosfolipid Vezikül Etkileşimlerini İncelemek için Kantitatif Akış Sitometrisi

Özet

Kaynak: Podoplelova, N. et al., Kantitatif Akış Sitometrisi Kullanılarak Floresan Etiketli Proteinlerin Yapay Fosfolipid Mikro-Parçacıklarla Etkileşiminin İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu videoda, kantitatif akış sitometrisi kullanarak proteinler ve yapay fosfolipid veziküller arasındaki etkileşimi gösteriyoruz. Floresan etiketli proteinlerin floresan etiketli fosfolipid veziküllere bağlanması, ortalama floresan yoğunluğunu arttırır ve bu artış bir akış sitometresi ile tespit edilir.

Protokol

>1. Akış sitometrisi ile protein-lipid etkileşiminin tespiti

1. Kinetik bağlanma deneyleri
   1. Tyrode tamponundaki fosfolipid vezikülleri (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0.4 mM NaH₂PO₄, 2.5 mM CaCl₂, 5 mM glikoz, %0.5 BSA, pH 7.4) 1 μM konsantrasyona ve toplam 250 μL hacme seyreltin.
   2. 500 nM'lik bir konsantrasyonda 1. adımdan floresan etiketli pıhtılaşma faktörü X'i (fX-fd) 1.1.1. adımdaki fosfolipid veziküllerle 1: 1 oranında (nihai vezikül konsantrasyonu 0.5 μM, fX-fd konsantrasyonu 250 nM fX'tir) toplam 500 μL hacme karıştırın.
   3. Karışık süspansiyonun 500 μL'sini (düşük akış hızıyla analiz için ~ 20 dakika) hemen akış sitometresine enjekte edin. Düşük bir akış hızı kullanın ve FL2 kanalı için eşiğin (uyarma 488 nm, emisyon filtresi 585/42 nm) 200 değeri olduğundan emin olun. Malzeme Tablosundan floresan boya için FL4 kanalındaki (uyarma 633 nm, emisyon filtresi 660/20) ortalama floresansı ölçün.
      not: Otomatik örnekleyici olmayan bir sitometre seçin. Bu, numunenin ölçüm hücresine enjeksiyon sürecini hızlandıracaktır.
   4. Bağlanma doygunluğu elde edildiğinde (5 dakika içinde floresanda önemli bir artış olmaz), numuneyi Tyrode tamponu ile hızla 20 kat seyreltin ve temel floresansa ulaşılana kadar (tam ayrışma) veya bir platoya ulaşılana kadar (5 dakika içinde floresanda önemli bir azalma yok) ayrışmayı izleyin.
      not: Kontrol olarak, 10 μM EDTA ekleyin ve 5 dakika boyunca tam ayrışmayı izleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)	Thermo Fisher Bilimsel	A37573 Serisi	Floresan boya
BD FACSCantoII	BD Biyobilim
DiIC16(3) (1,1'-Dihekzadesil-3,3,3',3'-Tetrametilindokarbosiyanin Perklorat)	Thermo Fisher Bilimsel	D384	Floresan boya
DMSO (Türkçe)	Sigma Aldrich	D8418
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Sigma Aldrich	H4034-500G
L-α-fosfatidilserin (Beyin, Domuz) (sodyum tuzu)	Avanti Polar Lipidler	840032P
L-α-fosfatidilkolin (Beyin, Domuz)	Avanti Polar Lipidler	840053P
Mini Ekstruder	Avanti Polar Lipidler	610020-1 adet
Potasyum klorür	Sigma Aldrich	P9541-500G
Kalsiyum klorür, susuz, toz, %≥97	Sigma Aldrich	C4901-100G
Sodyum fosfat monobazik	Sigma Aldrich	S3139-250G
Sodyum klorür	Sigma Aldrich	S3014-500G
Magnezyum klorür	Sigma Aldrich	M8266-100G
Sığır serum albümini	VWR Yaşam Bilimleri AMRESCO	-O332-0.1
EDTA disodyum tuzu	VWR Yaşam Bilimleri AMRESCO	-O105B-0.1